N6-甲基腺苷甲基化及其與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展

胡威，祝恒成

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

甲基化是甲基(-CH3)添加到一個(gè)分子上，并在核酸上觀察到甲基化基團(tuán)。DNA、RNA和多種蛋白質(zhì)，包括組蛋白均可甲基化。DNA甲基化主要是在啟動(dòng)子區(qū)域，而組蛋白甲基化對(duì)生物體的影響主要取決于甲基化水平和甲基化殘基在組蛋白上的位置[1]。除了DNA和組蛋白的甲基化，另一個(gè)水平的表觀遺傳調(diào)控已成為近幾年來生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，即RNA甲基化。RNA甲基化是真核細(xì)胞表觀遺傳的關(guān)鍵過程，決定其組蛋白結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)[1,2]。RNA甲基化是RNA修飾中最重要的一種，目前已探明的RNA修飾超過100種。RNA甲基化可存在于多種RNA分子中，如mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反義RNA、核酶和非編碼RNA等，但主要存在于mRNA中，mRNA甲基化主要用于維持mRNA的穩(wěn)定性[2，3]。RNA甲基化修飾在mRNA處理(剪接、多聚腺苷酸化等)、定位、小RNA處理、tRNA穩(wěn)定和翻譯抑制或激活中均起重要調(diào)節(jié)作用。這些規(guī)則對(duì)組織發(fā)育、晝夜節(jié)律、DNA損傷反應(yīng)、性別選擇及包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展均有較大影響。mRNA最常見的內(nèi)部修飾包括N6-甲基腺苷(m6A)甲基化、5-胞嘧啶(m5C)甲基化等。m6A甲基化是一種動(dòng)態(tài)、可逆的修飾，其涉及真核細(xì)胞的多種生理過程，如mRNA及miRNA加工、mRNA定位、翻譯抑制或激活。m6A甲基化影響機(jī)體多種重要的生物過程，如組織發(fā)育、性別選擇和DNA損傷反應(yīng)等[1～3]，現(xiàn)將m6A甲基化及其與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展綜述如下。

1 m6A甲基化

modomics數(shù)據(jù)庫是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫，包含與RNA修飾途徑相關(guān)的信息。迄今為止，已有171個(gè)RNA修飾被描述，其中包括72個(gè)甲基化修飾[4]。mRNA最常見的內(nèi)部修飾包括m6A甲基化、m5C甲基化等。m5C甲基化是將甲基添加到胞嘧啶核苷酸的第5位碳(C)原子，m6A甲基化即將甲基添加至碳環(huán)腺苷酸的第6位氮(N)原子[5，6]。

m6A甲基化最初在20世紀(jì)70年代被確定，是最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾，占總RNA修飾的50%以上。由于受技術(shù)條件限制，其早期研究較困難。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展及表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的逐步深入，m6A甲基化在不同生物學(xué)過程中的功能和作用再次受到關(guān)注。近年來，高等真核生物特別是mRNA分子的主要內(nèi)部修飾越來越引起重視。通過m6A甲基化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合的影響，將影響mRNA分子剪接、定位、多腺苷酸化、翻譯、衰變的每一步。

m6A甲基化有別于其他mRNA內(nèi)部修飾(如m5C)，其在不改變堿基序列的情況下對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，通過影響mRNA與讀取蛋白的結(jié)合，從而調(diào)控mRNA的剪接、翻譯和穩(wěn)定。m6A甲基化過程可逆，可精確調(diào)控，這一獨(dú)特過程是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的。①甲基化，加入甲基轉(zhuǎn)移酶的酶(讀取蛋白，Writer)；②去甲基化，即去除甲基，通過去甲基酶(擦除蛋白)將甲基從碳環(huán)上剝離；③識(shí)別發(fā)生甲基化修飾的RNA堿基位點(diǎn)，并綁定它們，執(zhí)行特定的生物功能(結(jié)合蛋白)[7,8]。目前已發(fā)現(xiàn)的讀取蛋白主要有甲基轉(zhuǎn)移酶-Like家族METTL3、METTL4、METTL14、WTAP(Wilms腫瘤結(jié)合蛋白)和KIAA1429、RBM15、CBLL1、2C3H13等[7～9]。已發(fā)現(xiàn)的擦除蛋白僅有脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白(FTO)、ALKB家族同系物5(ALKBH5)[10,11]。結(jié)合蛋白主要有YTH家族的蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1等[12,13]。

如上所述，完成m6A甲基化過程，需讀取蛋白、擦除蛋白、結(jié)合蛋白共同參與。這三種蛋白并不是單一的蛋白，而是三種大蛋白質(zhì)復(fù)合物合并在一起，再組成一個(gè)超大的蛋白質(zhì)復(fù)合物。讀取蛋白蛋白質(zhì)復(fù)合物負(fù)責(zé)在腺苷殘基芳環(huán)第6個(gè)碳上向甲基中加入甲基，該復(fù)合物含有由METTL3、METTL4和METTL14蛋白組成的核心結(jié)構(gòu)，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性[14]。另一種蛋白，Wilms腫瘤相關(guān)蛋白(WTAP)亦包括在該復(fù)合物中。其與METTL3、METTL4、METTL14相互作用，是定位于富含前mRNA加工因子的核斑點(diǎn)和體內(nèi)m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的催化活性所必需。除了METTL3、METTL14和WTAP、RBM15、KIAA1429等蛋白外，ZC3H13和CBLL1亦存在于m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中。盡管很早就鑒定了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物(讀取蛋白)的組分，但直至2010年才在高等真核細(xì)胞中鑒定出m6A去甲基化酶(擦除蛋白)，并發(fā)現(xiàn)FTO和ALKBH5為哺乳動(dòng)物僅有的兩種去甲基化酶(擦除蛋白)[10,11]。在體外和體內(nèi)均可通過氧化逆轉(zhuǎn)mRNA中的m6A甲基化過程。這一發(fā)現(xiàn)表明m6A修飾是可逆的，并且是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的。m6A可通過調(diào)節(jié)多種RNA相關(guān)細(xì)胞途徑來影響基因表達(dá)，并決定RNA在細(xì)胞中的命運(yùn)，能使細(xì)胞對(duì)各種環(huán)境信號(hào)產(chǎn)生快速反應(yīng)，包括哺乳動(dòng)物的能量來源[14,15]。

一旦m6A甲基化修飾過程啟動(dòng)，部分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白(結(jié)合蛋白)將識(shí)別修飾位點(diǎn)并綁定到RNA上以執(zhí)行其特定的功能。目前已被鑒定的主要結(jié)合蛋白是含YT521-B同源(YTH家族)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3等[14，16]。綁定不同YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白將對(duì)m6A位點(diǎn)的不同亞群產(chǎn)生不同影響,并導(dǎo)致其對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生不同影響。如YTHDF2的結(jié)合導(dǎo)致結(jié)合的mRNA定位于mRNA衰變位點(diǎn),導(dǎo)致m6A修飾的mRNA穩(wěn)定性降低和轉(zhuǎn)換增加,另一方面，YTHDF1與修飾的mRNA結(jié)合并通過與翻譯啟動(dòng)因子eIF3相互作用,而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。YTHDF3則能與YTHDF1、YTHDF2協(xié)同作用，當(dāng)與YTHDF1、YTHDF2結(jié)合時(shí)，其分別加速mRNA的衰變和翻譯啟動(dòng)過程[14]。

除了調(diào)節(jié)mRNA的功能外，m6A甲基化亦參與了前體miRNA(pri-miRNA)的加工。研究發(fā)現(xiàn)，m6A識(shí)別酶(HNRNPA2B1)將mRNA微處理器復(fù)合蛋白募集到經(jīng)m6A甲基化修飾的RNA位點(diǎn)，并將原代pri-miRNA加工成成熟的miRNA。生物物理學(xué)研究表明，m6A修飾亦可對(duì)RNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接影響。未修飾的腺苷殘基可與RNA結(jié)構(gòu)中的相鄰堿基形成鍵。但當(dāng)用m6A甲基化修飾殘基時(shí)，這使RNA雙鏈體結(jié)構(gòu)(發(fā)卡狀RNA)不穩(wěn)定，將導(dǎo)致與m6A位點(diǎn)相鄰的堿基傾向于斷裂形成單鏈。反之，通過控制m6A甲基化進(jìn)程可間接控制發(fā)卡狀RNA的穩(wěn)定性，這種現(xiàn)象稱為“m6A開關(guān)”[15,17]。

2 RNA甲基化的檢測(cè)方法

雖然RNA甲基化的研究很早就已啟動(dòng)，但由于技術(shù)上的限制一直停滯不前。直到最近幾年隨著高通量測(cè)序及分析化學(xué)工具的升級(jí)，加快了RNA修飾的研究。目前已開發(fā)了幾種用于檢測(cè)RNA甲基化的方法，有基于亞硫酸氫鹽修飾和非甲基化胞嘧啶化學(xué)修飾；有二代測(cè)序方法，如亞硫酸氫鹽測(cè)序、焦磷酸測(cè)序；也有傳統(tǒng)的、經(jīng)濟(jì)的基于PCR的方法，如利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性或限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性等。RNA結(jié)構(gòu)和代謝的RNA甲基化鑒定需要與新穎的高通量方法相結(jié)合。由于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的非甲基化胞嘧啶殘基可轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，m5C修飾可輕松被檢測(cè)到。基于此原理，已有多種檢測(cè)方法并廣泛使用。然而，與m5C不同，m6A甲基化無化學(xué)轉(zhuǎn)化過程，缺乏用于檢測(cè)RNA修飾及其靜態(tài)、不可逆性質(zhì)的敏感方法。斑點(diǎn)印跡和高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜相結(jié)合可能成為檢測(cè)m6A修飾的有用工具。但這些技術(shù)不適合識(shí)別修飾位點(diǎn)的定位[18～23]。微量RNA全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜分析(m6A-seq/MeRIP-seq)，是一種免疫沉淀法，是識(shí)別m6A的重要工具，該工具具有準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，且所需的MeRIP-seq總RNA起始量低，僅需500 ng。通過與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合的極小RNA片段(100～200 nt)將m6A-seq/MeRIP-seq法進(jìn)一步改進(jìn)，分辨率進(jìn)一步提高，可直接定位到單個(gè)核苷酸。改進(jìn)后的方法被稱為單個(gè)m6A-核苷酸-拆分-交聯(lián)和免疫沉淀法(miCLIP)。miCLIP現(xiàn)已用于多種類型細(xì)胞及生物中m6A的定位，揭示其潛在功能[23]。此外，研究人員已建立可預(yù)測(cè)m6A甲基化信息的數(shù)據(jù)庫，名為RMBaseV2.0數(shù)據(jù)庫(http://rna.sysu. edu.cn/rmbase/)，其收錄了13個(gè)物種的多個(gè)RNA表觀遺傳修飾的測(cè)序數(shù)據(jù)及m6A甲基化的具體位點(diǎn)。隨著檢測(cè)m6A甲基化位點(diǎn)的技術(shù)不斷提高，為研究m6A甲基化與各類疾病的關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

3 m6A甲基化與腫瘤的關(guān)系

腫瘤的主要標(biāo)志是基因表達(dá)的異常。m6A對(duì)控制細(xì)胞分化和多樣性有重要作用。最近研究強(qiáng)調(diào)，m6A不僅通過調(diào)控基因表達(dá)影響癌癥的發(fā)展，其還影響癌癥干細(xì)胞分化的多樣性，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和潛在的腫瘤免疫等過程，這使其成為一種新的、前景廣闊的腫瘤治療途徑[3，12,14]。

METTL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2被認(rèn)為是不同類型腫瘤中的異常甲基化分子。目前研究報(bào)道較多的是造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞具有多種分化途徑以達(dá)到其最終分化狀態(tài)，m6A甲基化可改變其正常的分化途徑，并導(dǎo)致異常祖細(xì)胞狀態(tài)。研究表明，與正常人造血干/祖細(xì)胞(HSPCs)相比，急性髓細(xì)胞性白血病(AML)細(xì)胞中METTL3 mRNA和蛋白表達(dá)升高。下調(diào)AML細(xì)胞系中的METTL3基因表達(dá),能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，從而延緩患者白血病的進(jìn)展。與METTL3(m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的另一個(gè)關(guān)鍵組分)一樣，METTL14亦在正常HSPCs和AML細(xì)胞中高表達(dá)，并在骨髓分化過程中表達(dá)下調(diào)。在HSPCs和AML細(xì)胞中沉默METTL14基因可促進(jìn)末端骨髓分化,并抑制AML細(xì)胞的存活和增殖[17,18]。

另一方面，作為m6A脫甲基酶(擦除蛋白)的FTO在部分AML細(xì)胞中高表達(dá)。在FTO介導(dǎo)的m6A RNA甲基化水平降低時(shí)mRNA穩(wěn)定性同時(shí)降低，這將導(dǎo)致細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)盒2和視黃酸受體α兩種基因表達(dá)受抑制，從而延緩AML發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，降低m6A mRNA表達(dá)對(duì)于維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(GSC)生長(zhǎng)、自我更新和腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。敲低METTL3或METTL14的表達(dá)能降低其靶基因m6A mRNA的表達(dá)。此外，通過抑制擦除蛋白FTO基因表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展并延長(zhǎng)GSC移植小鼠的壽命。另外擦除蛋白ALKBH5基因還影響GSC細(xì)胞周期，ALKBH5在GSC組織中高表達(dá)，能使叉頭框蛋白M1(FOXM1)新生轉(zhuǎn)錄物去甲基化，這將影響mRNA的穩(wěn)定性，導(dǎo)致FOXM1蛋白表達(dá)下降。FOXM1是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,在細(xì)胞周期中扮演重要角色。FOXM1特異性高表達(dá)于增殖期細(xì)胞和多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中，但在細(xì)胞靜止、分化末期不表達(dá)[14,15,17]。

乳腺癌細(xì)胞MCF-7暴露于缺氧環(huán)境可刺激缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α依賴性的去甲基酶(擦除蛋白)ALKBH5的表達(dá)。ALKBH5通過m6A去甲基化影響NANOG基因mRNA的穩(wěn)定性。NANOG基因是一種多能性因子，2003年在胚胎干細(xì)胞中新發(fā)現(xiàn)的重要基因，是維持癌癥干細(xì)胞所必需的。所以，增加m6A去甲基化將會(huì)影響乳腺癌干細(xì)胞的表型。此外，乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白(HBXIP)能通過抑制乳腺癌中l(wèi)et-7g家族miRNA表達(dá),上調(diào)讀取蛋白METTL3的表達(dá)，升高的METTL3又反過來增加HBXIP的表達(dá)，形成正反饋循環(huán)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖加速。另一方面，在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中，METTL3的過表達(dá)能抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(SOCS2)，并通過m6A-YTHDF2途徑促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。然而，m6A讀取蛋白的另一個(gè)成分METTL14能促進(jìn)miR-126的表達(dá)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。因miR-126可抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18,19]。

結(jié)合蛋白YTHDF2的mRNA及蛋白在人胰腺癌細(xì)胞中較正常細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，并通過Akt/GSK-3β/Cyclin D1信號(hào)通路，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)通過抑制上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和黏附。所以YTHDF2起到協(xié)調(diào)胰腺癌細(xì)胞遷移、增殖的作用。此外，m6A甲基化能影響前體RNA-premiR125b并降低成熟miR-125b表達(dá)，導(dǎo)致其靶基因產(chǎn)物如生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2表達(dá)增加，并促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[20～22]。

總之，m6A甲基化和腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究目前尚處于起步階段，僅部分血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等報(bào)道較多，其他報(bào)道較少[24～26]。主要原因?yàn)閙6A甲基化過程所涉及的基因過多。m6A修飾過程需要讀取蛋白、擦除蛋白、結(jié)合蛋白這三類基因共同參與，且每種基因在不同癌癥中的表現(xiàn)可能千差萬別，如FTO基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)為癌基因，通過抑制FTO基因表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展；但在腎腫瘤或其他腫瘤組織中FTO可能為抑癌基因。此外由于擦除蛋白類的基因本身自帶去甲基化功能，過表達(dá)FTO基因，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞或組織m6A甲基化減少，反過來導(dǎo)致讀取蛋白或結(jié)合蛋白這兩類基因中的潛在癌基因或抑癌基因表達(dá)下調(diào)，將加速或減緩腫瘤發(fā)生發(fā)展。m6A甲基化過程在不同腫瘤中的表現(xiàn)可能千差萬別，需要進(jìn)一步將研究精細(xì)化，并進(jìn)一步了解讀取蛋白、擦除蛋白、結(jié)合蛋白在腫瘤中的作用機(jī)制及相互影響。另外，讀取蛋白、擦除蛋白、結(jié)合蛋白間的聯(lián)系，為研究提供了新的思路，對(duì)腫瘤的調(diào)控更精細(xì)化、多樣化，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)癌基因及抑癌基因的精準(zhǔn)化、可逆化、動(dòng)態(tài)調(diào)控。此外，m6A甲基化將腫瘤的診斷、治療提高到了分子水平。對(duì)m6A甲基化位點(diǎn)的研究可協(xié)助尋找新的分子診斷、治療的靶點(diǎn)，為臨床提供新思路。