線栓插入深度對(duì)改良線栓法制備小鼠腦缺血模型穩(wěn)定性及安全性的影響

莊麗華，孔營(yíng)楠，楊爍慧，龔志剛，詹松華，劉孟瀟，張中帥

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海201203；2西門(mén)子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司上海分部)

目前我國(guó)缺血性腦梗死發(fā)病率高，約占其他類型腦梗死的66.4%[1]。缺血性腦梗死已成為全世界首位死亡原因，具有發(fā)病率高、病死率高和致殘率高的特點(diǎn)[2，3]。大腦中動(dòng)脈栓塞模型為研究腦缺血疾病的重要模型，其主要造模方法為線栓法。相關(guān)研究多使用大鼠造模，但大鼠不能滿足腦缺血疾病基因水平的研究。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，小鼠和基因工程小鼠已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)[4，5]。建立穩(wěn)定的小鼠腦缺血模型，并創(chuàng)立準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的模型評(píng)價(jià)體系，是目前研究的關(guān)鍵。過(guò)去常用TTC染色法來(lái)判定模型小鼠腦缺血范圍，但該方法無(wú)法對(duì)活體小鼠進(jìn)行觀察[6～9]。隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可利用磁共振掃描技術(shù)對(duì)小鼠進(jìn)行活體多層面成像檢查[10～14]。2017年10月～2018年4月，本研究用改良線栓構(gòu)建小鼠腦缺血模型，觀察線栓插入深度對(duì)模型穩(wěn)定性及安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 成年SPF級(jí)C57/BL6n小鼠40只，雄性，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK(浙)2018-0001，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度18～28 ℃，晝夜溫差<3 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食不禁水。青霉素鈉粉針劑，購(gòu)自上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，水合氯醛購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。線栓購(gòu)自北京西濃科技有限公司，直徑0.16 mm，頭部直徑(0.2±0.1)mm，線長(zhǎng)3.5 cm，距離頭端10 mm處有黑色標(biāo)記，并于標(biāo)記處前后1 mm處加兩個(gè)標(biāo)記。磁共振掃描儀(西門(mén)子Skyra3.0T)、8通道橫向放置小鼠專用線圈(上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司，編號(hào)5000049101/序列號(hào)001006)。

1.2 動(dòng)物分組及腦缺血模型制備 將40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D組，每組10只。將小鼠稱質(zhì)量后用4%水合氯醛溶液按0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，將其仰臥位固定于泡沫紙板上，乙醇擦拭頸部消毒，用眼科鑷在頸部正中剪1 cm左右切口，鈍性分離下頜下腺，用玻璃分針游離胸骨舌骨肌及二腹肌之間的頸動(dòng)脈鞘，分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，在頸總動(dòng)脈上掛線，并繼續(xù)向前剝離分出頸外動(dòng)脈，將頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈結(jié)扎。將線栓插入0.4 mm注射器針頭，針頭經(jīng)頸總動(dòng)脈近心端靠近結(jié)扎處插入，推入線栓，退出針頭，繼續(xù)往前推送線栓。B、C、D組線栓頭端距頸總動(dòng)脈分叉處距離分別為9、10、11 mm，標(biāo)記點(diǎn)到達(dá)頸總動(dòng)脈分叉時(shí)停止，固定頸總動(dòng)脈及其內(nèi)線栓，剪減掉多余部分線栓及線頭。沖洗創(chuàng)面并縫合皮膚，將小鼠置于保溫棉墊上，待其蘇醒后單籠飼養(yǎng)。A組為假手術(shù)組，分離步驟同B、C、D組，分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后用手術(shù)線結(jié)扎，不插入線栓。各組術(shù)后均腹腔注射4萬(wàn)U青霉素鈉溶液。

1.3 小鼠神經(jīng)行為判定標(biāo)準(zhǔn) 分別于小鼠完全清醒后(術(shù)后)、磁共振掃描前采用Longa′s神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)價(jià)其神經(jīng)功能。Longa′s神經(jīng)功能評(píng)分0分：無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：垂直提尾時(shí)不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分：死亡。

1.4 磁共振掃描及腦梗死范圍測(cè)算 造模24 h，采用4%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將其置于8通道橫向放置小鼠專用線圈中央，采取俯臥位固定，用西門(mén)子Skyra3.0T磁共振儀進(jìn)行掃描，T1WI、T2WI采用快速自旋回波序列掃描，DWI采用梯度回波掃描。參數(shù)設(shè)置如下：T1WI TSE-TRA脈沖序列重復(fù)時(shí)間(TR)500 ms，回波時(shí)間(TE)13 ms，翻轉(zhuǎn)角131°，視野60 mm×48 mm，帶寬244 Hz/Px，激勵(lì)次數(shù)3，矩陣256×256，層數(shù)8層，掃描時(shí)間167 s；T1WI TSE-COR，TR 761 ms，TE 13 ms，翻轉(zhuǎn)角131°，視野60 mm×36 mm，帶寬244 Hz/Px，激勵(lì)次數(shù)4，矩陣256×256，層數(shù)10層，掃描時(shí)間171 s；T2WI TSE-TRA，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻轉(zhuǎn)角150°，視野60 mm×48 mm，帶寬260 Hz/Px，激勵(lì)次數(shù)2，矩陣256×256，層數(shù)8層，掃描時(shí)間179 s；T2WI TSE-COR，TR 3800 ms，TE 80 ms，翻轉(zhuǎn)角150°，視野60 mm×36 mm，帶寬260 Hz/Px，激勵(lì)次數(shù)4，矩陣256×256，層數(shù)10層，掃描時(shí)間171 s。因磁共振掃描小鼠冠狀位層面多于橫斷位層面，故從冠狀位層面計(jì)算腦梗死體積。采用Image pro plus6.0軟件計(jì)算小鼠每個(gè)層面腦梗死面積，梗死面積×層厚為腦梗死體積，腦梗死體積占全腦總體積的百分比即為腦梗死范圍。

2 結(jié)果

2.1 各組造模情況 術(shù)后24 h磁共振掃描前，A組無(wú)死亡；B組存活9只，因腦疝死亡1只，造模成功6只；C組存活8只，因嚴(yán)重腦水腫死亡1只、原因不明死亡1只，造模成功7只；D組存活5只，因腦出血死亡3只、嚴(yán)重腦水腫死亡2只，造模成功4只。

2.2 各組存活小鼠術(shù)后及磁共振掃描前神經(jīng)功能比較 A、B、C、D組存活小鼠術(shù)后Longa′s神經(jīng)功能評(píng)分分別為0、1、2、2分；磁共振掃描前分別為0、1、3、2分。術(shù)后C、D組Longa′s神經(jīng)功能評(píng)分高于A組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；B組高于A組，低于C、D組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。磁共振掃描前C組Longa′s神經(jīng)功能評(píng)分高于A組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B、D組高于A組，低于C組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組磁共振掃描結(jié)果及腦梗死范圍比較 磁共振掃描結(jié)果顯示,A組T1WI及T2WI無(wú)明顯信號(hào)改變，B、C、D組分別有3、1、1只無(wú)明顯信號(hào)改變，其他均出現(xiàn)不同程度的T2WI高信號(hào)區(qū)域。B、C、D組腦梗死范圍分別為(17.13±8.32)%、(26.63±5.76)%、(27.52±5.81)%。C、D組腦梗死范圍大于B組(P均<0.05)，C組腦梗死范圍與D組相當(dāng)(P>0.05)。

3 討論

1986年Koizumi等[15]首次通過(guò)頸總動(dòng)脈開(kāi)口插入線栓制備大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型。Longa等[16]在Koizumi的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)頸外動(dòng)脈開(kāi)口制備大鼠可逆性腦栓塞模型。線栓法的優(yōu)點(diǎn)在于術(shù)中對(duì)血壓、體溫、血生化等影響小，避免開(kāi)顱對(duì)顱內(nèi)環(huán)境的影響；穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，可進(jìn)行缺血再灌注相關(guān)研究，應(yīng)用頗為廣泛[17～20]。但該方法操作復(fù)雜，要求操作者動(dòng)作精細(xì)準(zhǔn)確，否則極易發(fā)生出血及血管痙攣等并發(fā)癥，同時(shí)存在諸多影響因素，需后續(xù)研究不斷改進(jìn)與完善。

本研究制備永久性腦缺血模型，選用操作相對(duì)簡(jiǎn)單的頸總動(dòng)脈進(jìn)栓，重在探究線栓插入深度對(duì)成模率及安全性的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠頸內(nèi)動(dòng)脈解剖位置較深，難以分離，強(qiáng)制分離極易導(dǎo)致血管斷裂，而頸外動(dòng)脈可見(jiàn)部分短，難以像大鼠一樣從頸外開(kāi)口處置入線栓。因此，本研究在分離出頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈后，采用1 mL注射器針頭牽引線栓從頸總動(dòng)脈直接插入頸內(nèi)動(dòng)脈，可降低頸總動(dòng)脈斷裂的概率，且縮短了線栓插入時(shí)間，減少了出血量。由于小鼠體質(zhì)量小，血管細(xì)，血管韌性及彈性不如大鼠，成模率低。除去操作因素，造模時(shí)線栓頭端插入深度是小鼠腦缺血造模成功率的重要影響因素。如線栓頭端插入過(guò)淺，未能阻斷血流則不會(huì)發(fā)生梗死；如插入過(guò)深，則會(huì)導(dǎo)致出血，小鼠發(fā)生神經(jīng)功能缺損甚至死亡。本研究結(jié)果顯示，線栓頭端距頸總動(dòng)脈分叉處10 mm時(shí)安全性及成模率較高。線栓頭端距頸總動(dòng)脈分叉處距離為9 mm時(shí)，部分存活小鼠未發(fā)現(xiàn)信號(hào)改變區(qū)域，說(shuō)明未形成梗死灶，即造模失敗。當(dāng)線栓頭端距頸總動(dòng)脈分叉處距離為11 mm時(shí)，小鼠死亡率升高。

本研究觀察術(shù)后各組神經(jīng)功能評(píng)分，以初步觀察造模是否成功。各模型組發(fā)生不同程度神經(jīng)功能缺損，說(shuō)明線栓到達(dá)了大腦中動(dòng)脈起始部。磁共振掃描前各組神經(jīng)功能評(píng)分較術(shù)后略低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明從術(shù)后到磁共振掃描期間模型組神經(jīng)功能自我恢復(fù)并不明顯。有研究采用以上方法造模后1周內(nèi)模型的神經(jīng)功能評(píng)分與腦梗死體積不會(huì)自行恢復(fù)，而1周后才會(huì)大幅度恢復(fù)[21]。磁共振掃描前線栓插入10 mm與11 mm的小鼠神經(jīng)功能評(píng)分高于插入9 mm的小鼠，說(shuō)明插入9 mm深度不夠，未能完全阻塞大腦中動(dòng)脈。

磁共振掃描技術(shù)在臨床廣泛用于腦缺血的診斷[22,23]。在梗死急性期，DWI為高信號(hào)，T2WI或FLAIR像出現(xiàn)高信號(hào)；亞急性期時(shí)可見(jiàn)T1呈低信號(hào)。本研究結(jié)果顯示，梗死區(qū)域T1WI信號(hào)降低不明顯，T2WI及DWI明顯高信號(hào)。本研究使用8通道橫向放置小鼠線圈掃描，圖像質(zhì)量佳，病灶顯示清晰，可準(zhǔn)確判斷梗死灶及梗死范圍。部分小鼠無(wú)行為學(xué)損傷表現(xiàn)，但磁共振掃描T2WI有大片高信號(hào)區(qū)域。說(shuō)明小鼠行為學(xué)評(píng)分對(duì)梗死的判斷不如磁共振掃描靈敏。本研究發(fā)現(xiàn)，線栓插入10、11 mm時(shí)，腦梗死范圍大于插入9 mm；插入10 mm與11 mm時(shí)梗死部位穩(wěn)定，范圍較為一致。但插入11 mm時(shí)小鼠死亡率達(dá)50%。通過(guò)解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，部分小鼠大腦中動(dòng)脈被插破，部分小鼠因出血而發(fā)生神經(jīng)功能缺損。死亡和行為學(xué)表現(xiàn)均因出血所致，可見(jiàn)插入11 mm的深度易導(dǎo)致出血。

總之，線栓法是制作小鼠腦缺血模型的可靠方法。小鼠腦缺血模型制作難度大，進(jìn)線深度起決定性作用，過(guò)淺或過(guò)深均會(huì)影響腦缺血模型的安全性及穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。通過(guò)對(duì)插線深度的改良，制作較為穩(wěn)定的小鼠腦缺血模型。線栓插入深度為10 mm時(shí)安全性及成模率較高。但本研究也存在不足，各組小鼠樣本量少，需加大樣本量對(duì)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證；另外，本研究?jī)H對(duì)20～25 g的小鼠進(jìn)行觀察，其他品系及體質(zhì)量小鼠的適宜插入深度則需進(jìn)一步研究。盡管本研究得出了適宜插入深度，但由于小鼠大腦中動(dòng)脈直徑及頸總動(dòng)脈分叉至大腦中動(dòng)脈距離存在個(gè)體差異，因此在造模過(guò)程中操作人員的“手感”和熟練度起重要作用。