黃花菜組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

韓志平，張海霞，王麗君，張 琨

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同037009；3.山西大同大學(xué)，山西大同037009）

黃花菜（Hemerocallis citrina Bar.）屬百合科萱草屬多年生草本植物，是我國的特色蔬菜，其不僅營養(yǎng)豐富、味道鮮美，還具有藥用、觀賞和水土保持等方面的價(jià)值，在國內(nèi)外廣泛栽培[1]。甘肅慶陽、陜西大荔、山西大同、湖南祁東、江蘇宿遷、浙江縉云是我國黃花菜六大主產(chǎn)區(qū)[2]。各地農(nóng)藝工作者為了促進(jìn)黃花菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)其栽培模式和技術(shù)進(jìn)行了廣泛探索，并取得了一定的成效[3-8]。但是，黃花菜種苗的生產(chǎn)目前仍采用分株、芽塊、切片等傳統(tǒng)繁殖方法，不僅繁殖系數(shù)低、速度慢、周期長，還容易造成品種退化，難以滿足種苗大規(guī)模生產(chǎn)的需求，限制了黃花菜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[9-10]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)能在無菌條件下將離體的植物器官、組織、細(xì)胞等，在人工配制的培養(yǎng)基上，經(jīng)過脫分化和再分化形成完整的植株[11-12]。與傳統(tǒng)的繁殖方式相比，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能極大地縮短種苗的生產(chǎn)周期，大幅度增加繁殖系數(shù)，還能保持母本的優(yōu)良性狀，降低發(fā)生變異的概率，有利于實(shí)現(xiàn)種苗的快速繁殖、品種提純，甚至工廠化生產(chǎn)[13-14]。國內(nèi)早在20 世紀(jì)80 年代初就開始研究黃花菜的組織培養(yǎng)技術(shù)[15-17]，但至今仍沒有建立起成熟的黃花菜組培體系，國外相關(guān)報(bào)道也很少[18-19]。

筆者從組織培養(yǎng)育苗過程、外植體選擇和滅菌、培養(yǎng)基配方和激素對(duì)黃花菜組培效果的影響、試管苗移栽、組培常見問題等方面，綜述了黃花菜組織培養(yǎng)的相關(guān)研究，旨在為黃花菜組培體系的建立及其在黃花菜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 黃花菜組織培養(yǎng)育苗過程

1.1 洗配

洗配包括組培器具準(zhǔn)備和清洗、藥品稱量及培養(yǎng)基制備等過程[20]。培養(yǎng)基配制要做到藥品稱量準(zhǔn)確，器具潔凈，滅菌徹底。黃花菜組織培養(yǎng)中，MS 和N6 培養(yǎng)基及其1/2 劑量培養(yǎng)基都可以使用，其中，蔗糖2%、瓊脂0.8%，pH 值5.8～6.0。工廠化育苗時(shí)可用市售白砂糖代替蔗糖，用罐頭瓶取代三角瓶或組培瓶，生根培養(yǎng)時(shí)可用井水代替蒸餾水。

1.2 接種

接種包括外植體準(zhǔn)備、愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化和生根時(shí)材料的接種等。各階段材料接種時(shí)，關(guān)鍵是要做好器具和材料的滅菌消毒，在超凈臺(tái)上進(jìn)行無菌操作，并隨時(shí)觀察，避免污染，及時(shí)接種轉(zhuǎn)入下一階段[11]。實(shí)際生產(chǎn)中，一個(gè)熟練工每天能接種近100 瓶，每瓶接8 個(gè)外植體[21]。

1.3 培養(yǎng)

培養(yǎng)指接種后愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代、芽的分化和生根培養(yǎng)等過程。各階段培養(yǎng)基和激素的選擇以形成比例高、形態(tài)正常、無污染為標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到某一階段的標(biāo)準(zhǔn)后及時(shí)接種轉(zhuǎn)入下一階段培養(yǎng)[22]。不同外植體組織培養(yǎng)所經(jīng)歷的形態(tài)變化可能不同，要及時(shí)統(tǒng)計(jì)和拍照記錄愈傷組織形成、胚狀體、球狀體以及芽、根、苗的形態(tài)、顏色、數(shù)目、大小等數(shù)據(jù)。

1.4 移苗

移苗指試管苗長到一定大小時(shí)，經(jīng)過一定時(shí)間煉苗移栽到苗床，再經(jīng)過一定時(shí)間的生長轉(zhuǎn)移到土床進(jìn)行正常管理的過程。煉苗時(shí)要注意方法和時(shí)間，移苗的苗床可以蛭石或河沙為基質(zhì)，同時(shí)注意控制苗床濕度，防止試管苗腐爛死亡[23]。

2 黃花菜組織培養(yǎng)中外植體的選擇和滅菌

2.1 外植體的選擇

選擇適宜的外植體是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一。母株的生長狀態(tài)、年齡、基因型及外植體的取材部位和時(shí)間都會(huì)影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生[24]。黃花菜的幼嫩根尖、莖段、葉片、花薹、花柄、花瓣和種子等均可作為外植體，其中以莖、葉較為常用。但是不同外植體的內(nèi)部生理狀態(tài)不同，誘導(dǎo)愈傷組織的頻率、再生試管苗的難易和頻率均存在明顯差異，不同研究者的結(jié)果也不完全一致[21，25-26]。

蘇承剛等[27]以根狀莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生的幼苗長勢(shì)強(qiáng)，但只有取春季剛長出的幼嫩根狀莖才易培養(yǎng)。王鳳翱等[28]研究發(fā)現(xiàn)，幼葉、花薹、花柄、花絲等均能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，個(gè)別材料產(chǎn)生了不定芽、不定根，但以花薹、花柄誘導(dǎo)愈傷組織的頻率高。還有一些研究表明，在同種培養(yǎng)基上，花薹的出愈率最高，其次是花蕾、心葉，花絲、花被筒的出愈率最低[29-30]。還有研究發(fā)現(xiàn)，花柄的出愈率較花莖、葉片高，但花柄的出愈率與花期及花蕾大小有密切關(guān)系，且花柄的遺傳穩(wěn)定性較差，少數(shù)再生苗形態(tài)異常，不宜用作黃花菜組培外植體[25]。唐世建等[21]報(bào)道，花瓣再生效果明顯優(yōu)于心葉、花柄，花薹的誘導(dǎo)率最低；花瓣的誘導(dǎo)效果是越靠近基部越好，多層優(yōu)于單層，內(nèi)層優(yōu)于外層；花柄的誘導(dǎo)效果是兩端好、中間差；心葉的誘導(dǎo)效果與花瓣相似，也是越幼嫩效果越好，多層比單層好，里層比外層好。但是花器官只能在開花期取材，莖尖和葉片作外植體的取材時(shí)間較長、樣品也較充足、產(chǎn)生的試管苗健壯易活，較為實(shí)用[31]。

2.2 外植體的滅菌

無菌體系的建立是組織培養(yǎng)成功的另一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中，外植體的滅菌消毒又是重中之重，直接影響組織培養(yǎng)能否順利進(jìn)行[24]。滅菌標(biāo)準(zhǔn)是既要徹底殺死外植體表面的微生物，又要盡可能減輕對(duì)外植體組織和細(xì)胞的傷害[32]。與其他植物相似，黃花菜組培外植體常用酒精、升汞、漂白粉等滅菌：一般先用70%酒精浸泡0.5～1.0 min，再用無菌水沖洗3～5 次；浸入0.1%升汞中10～15 min，之后用無菌水沖洗4～5 次；最后用無菌濾紙吸干，將外植體切成0.5 cm 長待用[14，31]。也可以將材料洗凈并吸干水分后，用75%酒精浸泡30 s；再用飽和漂白粉溶液消毒12～15 min；而后用無菌水淋洗4～5 次；最后分割接種[17]。還可以先用洗衣粉漂洗干凈；再用1%新潔爾滅浸泡15 min，或用0.1%升汞消毒8 min，或用10%次氯酸鈉消毒20 min，用無菌水沖洗3～4 次；最后接種[29]。有研究表明，單獨(dú)使用升汞滅菌優(yōu)于單獨(dú)使用酒精、新潔爾滅或漂白粉，酒精與升汞配合滅菌效果更好[30]。

3 黃花菜組培試管苗的形成途徑

黃花菜組培試管苗的形成主要有4 種途徑[14]：一是器官型，即直接從外植體的基部長出試管苗；二是器官發(fā)生型，即外植體先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再分化形成試管苗；三是胚狀體型，即外植體先誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，再形成胚狀體，最后分化形成胚狀體苗；四是球狀體型，即外植體先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再形成球狀體，最后分化形成苗。其中，球狀體型途徑出苗數(shù)量多、質(zhì)量好、繁殖速度快，可作為工廠化育苗的一個(gè)有效途徑[28]。

外植體種類在一定程度上決定著試管苗的形成途徑。花薹、花蕾較易發(fā)生愈傷組織或不定芽，幼葉只能誘導(dǎo)出愈傷組織[29]。研究發(fā)現(xiàn)，激素水平相同時(shí)，幼葉與花藥試管苗的形成途徑完全不同[15]。幼葉形成試管苗的途徑是器官發(fā)生型，花藥形成試管苗的途徑是胚狀體型，花柄形成試管苗的途徑既可能是胚狀體型，也可能是球狀體型[25，33]。韓志平等[34]研究表明，黃花菜種子胚芽端組織培養(yǎng)可誘導(dǎo)形成不定芽或愈傷組織，不定芽繼續(xù)培養(yǎng)直接抽葉生根形成試管苗。

4 培養(yǎng)基和激素對(duì)黃花菜組培效果的影響

4.1 基本培養(yǎng)基對(duì)黃花菜組培效果的影響

對(duì)于器官發(fā)生型和球狀體型2 種途徑，MS 與N6 培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織無明顯差別[21]，多數(shù)研究者使用MS 培養(yǎng)基。有研究表明，用MS 培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)出胚狀體[35]。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，激素相同時(shí)，MS培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)胚狀體，N6 培養(yǎng)基則能誘導(dǎo)形成大量胚狀體，認(rèn)為N6 培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)胚狀體[33]。研究結(jié)果的差異可能與外植體、取材時(shí)間、試驗(yàn)條件不同有關(guān)。多數(shù)試驗(yàn)選用1/2 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)[31]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在不加激素的MS 培養(yǎng)基上，組培苗生根率可達(dá)95%以上，更適合進(jìn)行生根培養(yǎng)[27]。

此外，水解酪蛋白對(duì)誘導(dǎo)黃花菜外植體愈傷組織有明顯效果，在培養(yǎng)基中添加水解酪蛋白成分可使得花蕾、花薹切段發(fā)生愈傷組織，不定芽或胚狀體的誘導(dǎo)頻率明顯提高[29]。董雅茹等[23]研究表明，固體培養(yǎng)基生根率高，但根和地上部長勢(shì)不如液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基根系發(fā)達(dá)、根毛多，植株健壯，葉色深綠，移栽成活率高，同時(shí)液體培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)便、成本低，用于生根培養(yǎng)更好。

4.2 激素種類和配比對(duì)黃花菜組培效果的影響

在不同的培養(yǎng)階段，根據(jù)外植體類型和培養(yǎng)目的，激素種類和配比對(duì)黃花菜組培結(jié)果影響很大[36]。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，根狀莖在MS＋2，4-D 0.5～1.0 mg/L＋6-BA 0.1～0.5 mg/L 培養(yǎng)基上，出愈率可達(dá)90%以上[27]。以心葉為外植體時(shí)，MS＋2，4-D4 mg/L的出愈率最高；花薹、花絲、花被筒為外植體時(shí)，MS＋2，4-D 2 mg/L 的出愈率最高[30]。唐世建等[21]則報(bào)道，MS＋2，4-D 2.0～2.5 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L 誘導(dǎo)心葉、花瓣、花柄、花薹形成愈傷組織的效果最好，愈傷組織數(shù)量多、質(zhì)地較松散。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，花柄切段接種在添加NAA 0.05 ～0.20 mg/kg＋6-BA 2 mg/kg、NAA 0.2 mg/kg＋KT 2 mg/kg 或KT 1 mg/kg＋2，4-D 0.5 mg/kg 的MS 培養(yǎng)基上，均能誘導(dǎo)形成愈傷組織[37]。實(shí)際操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)外植體種類，選擇適宜的培養(yǎng)基和激素種類及其配比，從而提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

繼代培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中激素配比又有不同。根狀莖愈傷組織在MS 培養(yǎng)基上添加6-BA 1 mg/L＋NAA 0.01 mg/L 分化芽最好，芽分化率可達(dá)100%[27]。但也有研究表明，莖尖愈傷組織在MS＋6-BA4mg/L＋NAA 0.1 mg/L 上繼代培養(yǎng)最好[31]。還有學(xué)者報(bào)道，以MS＋6-BA 1 mg/L＋NAA 0.1 mg/L 進(jìn)行花薹、花絲、花被筒愈傷組織的芽分化效果最好[30]。唐世建等[21]研究則發(fā)現(xiàn)，在心葉、花薹、花瓣、花柄愈傷組織繼代培養(yǎng)中，2，4-D 用量越大，愈傷組織越緊密，6-BA 用量越大，愈傷組織越易分化，MS＋2，4-D 2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L 為最優(yōu)組合。

黃花菜組培苗常用1/2 MS 培養(yǎng)基添加NAA 0.2 mg/L 或IBA 0.2 mg/L 誘導(dǎo)生根，但在MS 培養(yǎng)基上，不添加激素生根率可達(dá)96%，添加NAA 后生根率明顯降低[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)，組培苗在不含有激素或只含有生長素的全量或半量MS 或N6 培養(yǎng)基上均能生根，但加入適量的NAA 可促進(jìn)生根[29]。因此，在選擇激素種類和濃度時(shí)，要充分考慮培養(yǎng)目的及基本培養(yǎng)基的影響。

5 黃花菜組織培養(yǎng)試管苗的移栽

黃花菜組培苗長出3～4 片葉、新根長1 cm 左右時(shí)要及時(shí)移苗。由于組培瓶?jī)?nèi)外環(huán)境差異較大，應(yīng)先打開瓶塞，在自然溫度下煉苗1～3 d，使小苗開始接觸并逐漸適應(yīng)外部環(huán)境。而后將試管苗從組培瓶中小心取出，洗去根上培養(yǎng)基，用吸水紙或紗布覆蓋根部3～4 d，促使根毛發(fā)生，再將苗栽入苗床或營養(yǎng)缽中，可以提高移栽成活率。實(shí)驗(yàn)室移苗一般以蛭石為苗床基質(zhì)，生產(chǎn)上常用河沙和泥土以體積比3∶1～4∶1 混合成苗床基質(zhì)[14]。研究表明，未經(jīng)滅菌的基質(zhì)中組培苗成活率與滅菌的基質(zhì)無明顯區(qū)別，均可達(dá)到90%以上[21]。配制基質(zhì)的土壤黏性要好，這樣保水性較好，也可使基質(zhì)表面干燥，以避免移苗后莖基部腐爛，提高組培苗的成活率，而且不需要對(duì)苗床基質(zhì)滅菌，可以節(jié)約人力、物力，降低生產(chǎn)成本[38]。

移栽后要控制苗床溫度，保持葉叢濕度。大棚內(nèi)溫度冬季保持15 ℃以上，夏季保持32 ℃以下，有利于組培苗的正常生長。苗成活后正常澆水施肥。小苗在苗床生長15～20 d 后，可轉(zhuǎn)移到土床培育，按常規(guī)育苗技術(shù)管理。生長30 d 后，苗高達(dá)15 cm、根長達(dá)20 cm 時(shí)，即可移栽到田間正常生長。如果白天氣溫高、陽光太強(qiáng)，要選擇午后或陰天移栽，并注意移栽后溫度、濕度、光照等的管理，防止傷苗[17]。

6 黃花菜組織培養(yǎng)常見問題及其解決方法

6.1 污染問題及其解決方法

植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常發(fā)生接種后或繼代培養(yǎng)后，材料或培養(yǎng)基污染發(fā)霉等問題。污染的原因可能是由于外植體的選擇和滅菌不徹底、培養(yǎng)基或培養(yǎng)器皿消毒不徹底、超凈臺(tái)不達(dá)標(biāo)或操作不當(dāng)、環(huán)境不潔凈等[22，39-40]。應(yīng)特別重視材料和器具的滅菌消毒，對(duì)組織培養(yǎng)涉及到的各種設(shè)備、器具、培養(yǎng)基、外植體等采用正確、恰當(dāng)?shù)臏缇痉椒?，全面、徹底進(jìn)行滅菌消毒，必要時(shí)可進(jìn)行二次滅菌，對(duì)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的已污染材料要及時(shí)進(jìn)行清理[41-43，26，34]。

6.2 組培苗的老化、 褐化和玻璃化問題及其解決方法

組培苗在組培瓶?jī)?nèi)時(shí)間過長，由于培養(yǎng)基有效成分減少，隨著小苗的生長和數(shù)量的增加以及空間、光照等的變化，常會(huì)出現(xiàn)小苗老化，如葉色變淡、植株枯萎、生長勢(shì)衰退等。為此，應(yīng)適時(shí)分離繼代培養(yǎng)，提高組培苗質(zhì)量[38]。在球狀體培養(yǎng)過程中，一旦球狀體外面幾層細(xì)胞出現(xiàn)黃褐色栓質(zhì)化時(shí)，應(yīng)及時(shí)割切轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，防止老化[28]。

在植物組織培養(yǎng)中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)外植體或培養(yǎng)物褐化、枯死，這種情況對(duì)外植體的脫分化和再分化有嚴(yán)重影響，對(duì)某些植物的組織培養(yǎng)起決定性作用[44-47]。影響褐化的因素有外植體的種類和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的成分和激素比例、培養(yǎng)條件等[48-49]。通過母株和外植體的預(yù)處理[50-51]、選擇適宜的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[52-53]、培養(yǎng)基中加入防褐劑[54]、連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體[55-56]等措施可有效減少褐化發(fā)生。

在愈傷組織繼代增殖過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量玻璃化現(xiàn)象，即葉片或莖段成水漬狀、半透明，葉片皺縮，脆弱易碎[57]。原因可能是由于培養(yǎng)環(huán)境濕度過高、溫度較高、光照太弱等原因，造成呼吸和光合性能降低，影響水分、營養(yǎng)和CO2的吸收，從而導(dǎo)致生長不良和玻璃化[58-59]。發(fā)現(xiàn)玻璃苗應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)瓶，置于適宜的培養(yǎng)環(huán)境下，增加光照強(qiáng)度和CO2濃度、降低培養(yǎng)溫度，大部分可轉(zhuǎn)化成正常苗[10，60]。

6.3 組培苗移栽的成活率問題及其解決方法

組培苗移栽是組織培養(yǎng)的最后階段，其成活率的高低是關(guān)系到組培成敗的關(guān)鍵問題。黃花菜組培苗生根后移栽成活率較低，主要是組培苗根系缺乏根毛，在外界自然環(huán)境下難以吸收水分和養(yǎng)分[28]。移栽成活率還與試管苗健壯程度、煉苗方法及時(shí)間、苗床基質(zhì)、移栽后的管理等有關(guān)[61]。因此，移苗前煉苗時(shí)必須設(shè)法促使根毛發(fā)生，以提高移栽成活率。移栽基質(zhì)要注意保水、保肥和通氣性。研究發(fā)現(xiàn)，球狀體苗相對(duì)健壯，容易成活，在組培過程中應(yīng)盡可能誘導(dǎo)球狀體苗。移苗要及時(shí)，移栽過遲，小苗在瓶?jī)?nèi)彎曲生長，使根與莖的極性受到影響，會(huì)出現(xiàn)根與苗同向生長，給移栽造成困難。成活率高低還與移栽時(shí)期有關(guān)[62]。春末夏初氣溫適宜、濕度較高，苗更易成活；冬季氣溫太低、仲夏氣溫過高、濕度低都不利于苗的成活和生長，若移苗需加強(qiáng)保溫、保濕，防止高溫和強(qiáng)光。

7 黃花菜組織培養(yǎng)的前景

黃花菜組織培養(yǎng)中存在愈傷組織誘導(dǎo)困難、組培苗發(fā)生途徑多樣、白化苗和污染較常見、組培苗移栽后成活率較低等問題。因此，目前黃花菜組織培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，加上其技術(shù)要求高、育苗成本大，至今沒有在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。但黃花菜組織培養(yǎng)具有2 個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：一是取材方便，不影響生產(chǎn)。不同部位的幼嫩組織均能形成試管苗，取材局限性小。而且由于是多年生宿根植物，再生能力強(qiáng)，可重復(fù)取材，對(duì)田間生產(chǎn)幾乎沒有影響。二是繁殖系數(shù)高，速度快。外植體接種后誘導(dǎo)愈傷組織約需10～15 d，有的愈傷組織再經(jīng)7 d 在原培養(yǎng)基上分化出苗，有的轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上經(jīng)15～20 d 分化出苗。有的外植體直接產(chǎn)生不定芽以及胚狀體，轉(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)10～20 d 長成小苗。試管苗分離培養(yǎng)后又可以多種途徑再次繁殖，且試管苗在組培瓶中生長很快，能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量植株，繁殖系數(shù)在60 d 內(nèi)可達(dá)到100 倍以上[38]。

因此，相關(guān)研究人員需要從組織培養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)深入研究黃花菜組織培養(yǎng)體系，包括適宜的外植體及其滅菌方法、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽發(fā)生、繼代、抽葉、生根等階段培養(yǎng)基和激素配比，以及組培苗的促生根毛方法、玻璃化和白化苗的轉(zhuǎn)變等。只有解決好這些問題才能夠建立起成熟完善的黃花菜組織培養(yǎng)體系，為黃花菜的工廠化育苗及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，從而推動(dòng)黃花菜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，為各產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和供給側(cè)改革作出貢獻(xiàn)。