筍芽頂端分生組織在竹稈橫切面形態(tài)形成中的作用與機制研究

王雨珺 魏 強

(南京林業(yè)大學竹類研究所 南京 210037)

竹類是一種獨特且重要的植物資源。竹筍可食，竹材可用，竹林還具有生長周期短、維護成本低等優(yōu)點，因此具有巨大的經(jīng)濟價值。如今，全世界有近22億人口的住房、食物以及經(jīng)濟收入依賴于竹產(chǎn)業(yè)；全球約有一半人口的生活和工作與竹產(chǎn)品的使用和貿(mào)易相關(guān)。目前，全球竹產(chǎn)業(yè)年貿(mào)易總額已經(jīng)超過25億美元，而人們對竹類資源的需求量仍在持續(xù)穩(wěn)步增長。要滿足人們對竹材資源日益增長的需求，就需要不斷提高竹林資源的栽培效率，提高效率的基礎(chǔ)則依賴于對這一獨特的禾本科植物生長發(fā)育的深入研究和全面認識。

竹稈作為竹材中最具利用價值的部分，其形態(tài)建成主要分為筍芽的分化、筍芽初生增粗生長以及竹筍的高生長3個重要階段。目前針對竹稈發(fā)育的研究大多集中在竹稈的高生長上，對筍芽增粗生長的研究極少。本團隊前期通過對毛竹筍芽初生增粗生長過程及厚竹厚壁性狀形成機制的研究發(fā)現(xiàn)，筍芽頂端分生組織(SAM)的形態(tài)和尺寸對于竹稈橫切面外輪廓形態(tài)與壁-腔結(jié)構(gòu)形成具有重要的作用。

為進一步深入研究筍芽頂端分生組織在竹稈發(fā)育中的作用及其機制，本研究選取了20種不同稈徑的竹種，比較分析了這些竹種筍芽SAM的形態(tài)特征，并且對SAM的尺寸、細胞數(shù)以及原體/原套細胞數(shù)比值等指標與稈徑值進行了相關(guān)性分析。此外，我們還針對一種SAM尺寸縮小，細胞數(shù)目減少并且原體/原套細胞數(shù)目比例失調(diào)的穩(wěn)定變異體——實肚竹(Phyllostachysnidulariaf.farcta)(屬于篌竹Ph.nidularia一種厚壁型穩(wěn)定變異體)進行了系統(tǒng)的研究。

1 材料方法與數(shù)據(jù)處理

1.1 不同稈徑竹種萌動芽SAM形態(tài)學比較分析

從南京林業(yè)大學竹種園(東經(jīng)118°81′，北緯32°08′)中選取了20種不同稈徑的散生竹(1,Pleioblastusargenteastriatus; 2,Shibataeachinensis; 3,Sasaellakongosanensis‘Aureostriatus’; 4,Chimonobambusasichuanensis; 5,Phyllostachysbissetii; 6,Pseudosasaamabilis; 7,Pseudosasajaponica; 8,Pleioblastusamarus; 9,Phyllostachysarcanaf.luteosulcata; 10,Semiarundinariasinica; 11,Phyllostachysglauca; 12,Brachystachyumdensiflorum; 13,Phyllostachysnigra; 14,Pleioblastusmaculatus; 15,Phyllostachysnidularia; 16,Indosasagigantea; 17,Sinobambusatootsik; 18,Phyllostachysnigravar.henonis; 19,Phyllostachysbambusoides; 20,Phyllostachysedulis)，每種竹隨機測量30根長勢中庸、無病蟲害、健康完整的一年生竹稈地徑，計算每種竹竹稈的平均地徑。隨后，挖取相應竹種萌動時期(S1時期)筍芽進行石蠟切片，每個竹種取5～10個生物學重復。通過石蠟切片，我們得到以上竹種筍芽的SAM縱切面形態(tài)，分別統(tǒng)計每種竹子筍芽SAM的高度、寬度、總細胞數(shù)、原套細胞數(shù)、原體細胞數(shù)以及原體/原套細胞數(shù)比值，將這些指標與對應竹種一年生竹稈平均地徑進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，筍芽SAM的高度、寬度、總細胞數(shù)、原套和原體部分細胞數(shù)目以及原體/原套細胞數(shù)比值均隨著稈徑的增加而呈增大的趨勢。其中，原體/原套的細胞數(shù)比值隨著SAM總細胞數(shù)目的增加呈明顯的線性增長。相關(guān)性分析顯示，以上SAM所有形態(tài)指標與稈徑均呈顯著相關(guān)，其中原體細胞數(shù)與稈徑的相關(guān)性系數(shù)最大(原文中圖1所示)。結(jié)合Photoshop CS6、MATLAB以及R軟件等分析工具，利用超橢圓方程對SAM外部輪廓進行擬合，結(jié)果表明筍芽SAM的外部輪廓形態(tài)在20個竹種中無明顯差異，均呈指狀(原文中圖2所示)。

1.2 實肚竹筍芽SAM形態(tài)特征分析

選取實肚竹與其原種篌竹S1時期，S2時期(發(fā)育前期)，S3時期(發(fā)育中后期)筍芽作為SAM形態(tài)學比較分析的實驗材料。2種筍芽均采集自其原始產(chǎn)地貴州省的荔波縣(北緯25°29′，東經(jīng)107°51′)。將3個不同發(fā)育時期的2種筍芽進行石蠟切片后，得到SAM的縱向切面圖。利用超橢圓方程分別對3個發(fā)育時期的實肚竹及篌竹筍芽的SAM外部輪廓進行擬合，發(fā)現(xiàn)2種筍芽之間以及不同發(fā)育時期筍芽之間，其SAM均具有相似的輪廓形態(tài)(原文中圖3所示)。進一步統(tǒng)計2種筍芽SAM的高度、寬度、高/寬比值、總細胞數(shù)目、原套細胞數(shù)、原體細胞數(shù)以及原體/原套細胞數(shù)比值后發(fā)現(xiàn)，實肚竹筍芽SAM較其原種篌竹具有尺寸縮小(高度、寬度、高/寬比值均降低)、細胞數(shù)目顯著減少(總細胞數(shù)、原套細胞數(shù)及原體細胞數(shù)均顯著降低)并且原體/原套細胞數(shù)比值顯著降低的特點(原文中圖3所示)。

1.3 實肚竹地下筍芽發(fā)育的細胞學過程

將實肚竹與篌竹3個發(fā)育時期(S1、S2、S3時期)的地下筍芽進行縱向石蠟切片觀察，對比分析各個發(fā)育時期兩種筍芽的細胞學特征，結(jié)果如原文圖4所示：實肚竹S1時期筍芽中髓組織分化不明顯，并且筍體中分化出了相對更多的壁組分組織(基本分生組織及肋狀分生組織)。在后續(xù)的發(fā)育時期中，實肚竹筍芽髓組織發(fā)育遲緩，并且髓組織中出現(xiàn)明顯的壁組分組織混入的紊亂現(xiàn)象(如原文圖4展示)。進一步對實肚竹及篌竹S2時期筍芽的髓細胞進行亞細胞觀察，發(fā)現(xiàn)其髓細胞的細胞壁形態(tài)曲折扭曲，胞間層及細胞間隙形態(tài)均發(fā)生變形(如原文圖5展示)，暗示實肚竹髓組織在發(fā)育過程中受到異常機械力擠壓。

1.4 實肚竹竹稈的形態(tài)及解剖學分析

分別選取實肚竹與篌竹1年生成熟竹稈作為形態(tài)學及解剖學分析的實驗材料。將竹稈每個節(jié)間的橫截面進行掃描(如原文圖6-A,B,E展示)，結(jié)果顯示實肚竹成熟竹稈節(jié)間具有多種竹壁加厚類型，一些疑似維管組織及基本組織出現(xiàn)在髓腔的中部。比較各節(jié)間橫截面上竹壁與髓腔的面積比，發(fā)現(xiàn)實肚竹竹稈各節(jié)間橫截面上的壁-腔面積比均顯著大于篌竹(如原文圖6-C展示)。利用超橢圓方程進行竹稈橫截面外部輪廓的擬合分析，結(jié)果顯示2種竹稈橫截面外部輪廓形態(tài)相似(如原文圖6-D)。選取2種竹稈各典型節(jié)間進行滑走切片以及掃描電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種竹稈典型竹壁部分的解剖結(jié)構(gòu)類似，實肚竹竹桿中的增生組織均為壁組分組織(維管組織及基本薄壁組織)，但位于髓腔中部的維管組織形態(tài)發(fā)育異常(如原文圖6-E—K)。選取標準竹測量2種竹稈的稈高、枝下高、節(jié)數(shù)、胸徑、地徑、平均節(jié)間長、平均節(jié)間寬、平均壁厚、以及竹稈各部分生物量。比較結(jié)果顯示，實肚竹竹稈的生物量較篌竹顯著降低，形態(tài)學指標中除了平均壁厚顯著高于篌竹之外，其他指標均顯著小于篌竹(如原文圖6-L, M)。

1.5 實肚竹與篌竹筍芽轉(zhuǎn)錄組比較分析

選取實肚竹與篌竹S1時期筍芽作為實驗樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，每種筍芽樣品設置了5個生物學重復。所有筍芽樣品均采集自貴州省荔波縣(北緯25°29′，東經(jīng)107°51′)。利用RNAprep Pure Kit (DP441)試劑盒對樣品進行總RNA提取。提取到高質(zhì)量RNA后，進行Strand-Specific RNA序列文庫的構(gòu)建和測序。利用Trimmomatic進行數(shù)據(jù)的過濾，即去除接頭和低質(zhì)量的序列，結(jié)果生成約1.41億個高質(zhì)量的read pairs，序列大小共約38 Gb。隨后使用Bowtie將得到的序列片段(長度>40 bp)與核糖體RNA(rRNA)數(shù)據(jù)庫進行對齊，刪除比對成功的片段后使用帶有默認參數(shù)的rnaSPAdes對序列進行重頭組裝。之后通過CD-HIT去除裝配后的冗余片段，再利用BUSCO來對裝配轉(zhuǎn)錄本進行評估，結(jié)果表明：組裝的單基因捕獲了核心保守植物基因的90.90%，完全捕獲了核心保守植物基因的77.71%。所有樣本的轉(zhuǎn)錄組譜在各個生物學重復中均具有較高的相關(guān)性(>0.9)。最后，利用BLASTx(e-value 為1e-5)在Swiss-Prot以及TrEMBL數(shù)據(jù)庫中對序列信息進行注釋。注釋完成后，將通過RSEM(v1.2.31)獲得的轉(zhuǎn)錄本原始計數(shù)輸入edgeR包中鑒定差異表達基因(DEGs)(將P值小于0.05，表達倍數(shù)(log2)絕對值>0.5的轉(zhuǎn)錄本認為是DEGs)。結(jié)果得到844個DEGs。這些DEGs中有343個在實肚竹S1期筍芽中顯著下調(diào)，有501個顯著上調(diào)。利用MapMan(v.3.5.1R2)軟件對差異基因進行可視化分析。結(jié)果顯示：與原種(篌竹)的S1時期筍芽相比，實肚竹筍芽中多種細胞學過程相關(guān)基因發(fā)生了顯著變化，如原文圖7中展示：大量與植物內(nèi)源激素代謝通路相關(guān)的基因，如脫落酸(ABA)、生長素(IAA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)相關(guān)基因在實肚竹S1時期筍芽中下調(diào)，而水楊酸(SA)相關(guān)基因則呈上調(diào)表達。此外，一系列與RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的DEGs在實肚竹中顯著下調(diào)，其中KNOTTED1likehomeobox，ELONGATOR和SIZ1等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子都曾被報道在莖頂端分生組織發(fā)育或細胞增殖和生長中發(fā)揮重要作用。此外，一些與“信號傳導”通路相關(guān)的DEGs也在實肚竹S1時期筍芽中顯著下調(diào)，如一系列與受體激酶、磷酸肌苷和MAPK激酶信號通路相關(guān)的基因。同時，如原文圖8中所示：一系列下游功能基因，如與DNA合成與修復、細胞壁合成、糖分代謝、次生代謝、氨基酸代謝以及與細胞活動相關(guān)的基因在實肚竹筍芽中顯著下調(diào)。在脂類代謝相關(guān)途徑中，一些與脂類降解、脂肪酸合成及糖脂合成相關(guān)的基因均在實肚竹筍芽中顯著上調(diào)，但其中與磷脂合成的相關(guān)基因卻在變異體中下調(diào)。此外，一系列與氮代謝和糖酵解相關(guān)基因表達量在實肚竹中顯著上調(diào)。大多數(shù)運輸相關(guān)的基因，如糖分、磷酸鹽、金屬、鉀和主要內(nèi)在蛋白質(zhì)運輸相關(guān)基因也在實肚竹筍芽中顯著上調(diào)表達。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果驗證

從差異表達基因中挑選了12個候選基因進行了qPCR驗證。這些基因包括：3個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子KNOX1，SIZ1和ELP1；5個分別與植物內(nèi)源激素ABA、BR、GA、SA和JA信號通路相關(guān)的差異基因；1個與信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因；1個與次生代謝相關(guān)的基因；1個與纖維素合成相關(guān)基因以及1個與糖脂類合成相關(guān)基因。利用用于測序的RNA作為模板，通過TransScript? One-step gDNA Removal and cDNA Sythesis SuperMix 試劑盒進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。內(nèi)參基因選用液泡膜內(nèi)在蛋白基因Tonoplast intrinsic protein (TIP41)。qPCR驗證結(jié)果顯示12個差異基因表達趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致(如原文中圖9所示)。

委托中國科學院遺傳與發(fā)育生物研究所對實肚竹及其原種篌竹S1期筍芽中的CKs與IAA含量進行檢測。結(jié)果如原文圖10所示，除iPR外，實肚竹筍芽中所有檢測到的其他CKs水平均明顯低于篌竹。而IAA在實肚竹S1時期筍芽中豐度也顯著小于其原種篌竹S1時期筍芽。

2 結(jié)論

竹類植物維持穩(wěn)定的SAM外輪廓指狀形態(tài)可能是其產(chǎn)生圓柱形竹稈的基礎(chǔ)；與此同時SAM細胞數(shù)目、原套與原體細胞數(shù)量比例在竹稈稈徑演化及正常壁-腔結(jié)構(gòu)形成上應具有重要作用。實肚竹筍芽SAM與其原種篌竹相比，尺寸縮小、細胞數(shù)目減少，原體/原套細胞數(shù)目比例降低。這使得其由原體細胞分化而來的髓組織比例降低，而由原套細胞分化而來的壁組分組織比例增加。這2種組織比例的失衡使得壁組分組織在筍芽后續(xù)發(fā)育過程中易隨機擠入髓組織中去，最終導致了實肚竹稈壁增厚且壁-腔結(jié)構(gòu)多樣化性狀的形成。細胞數(shù)目減少的頂端分生組織也導致了實肚竹筍芽中CKs和IAA含量較低，同時一系列與激素相關(guān)基因及其下游靶標基因的下調(diào)表達最終導致了實肚竹竹稈矮化、稈徑小且生物量低3種性狀的形成。一部分與SAM維持及細胞分裂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如KNOX1、ELPs和SIZ1在實肚竹筍芽中的下調(diào)可能是導致其SAM尺寸變小，細胞數(shù)目變少的分子原因。上述研究結(jié)果揭示了筍芽頂端分生組織外部形態(tài)、尺寸、細胞數(shù)目及原體/原套細胞數(shù)目比例在維持竹稈正常橫切面形態(tài)(圓形外部輪廓，稈壁圍繞髓腔呈規(guī)則環(huán)形分布的正常壁-腔結(jié)構(gòu))發(fā)育中的重要作用。此外，本研究還揭示了一系列與此過程相關(guān)的候選調(diào)控基因，為后續(xù)針對竹稈發(fā)育的深入研究奠定了較好的基礎(chǔ)。

原 文 出 處

Wang Y, Sun X, Ding Y,Fei Z, Jiao C, Fan M, Yao B, Xin P, Chu J, Wei Q. Cellular and molecular characterization of a thick-walled variant reveal a pivotal role of shoot apical meristem in transverse development of bamboo culm. Journal of Experimental Botany. 2019 Apr 30. doi:10.1093/jxb/erz201.