豬繁殖與呼吸綜合征的研究進(jìn)展

劉 賀，金 暉，陳 晨，姚鵬杰，祁思霖

（1.撫順市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 撫順 113006；2.遼寧省動(dòng)物及產(chǎn)品檢疫中心，沈陽(yáng) 110115；3.朝陽(yáng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 朝陽(yáng) 122000）

豬繁殖和呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬RNA病毒病，該病以流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和病弱仔豬，仔豬產(chǎn)出后因呼吸道疾病和繼發(fā)感染常常很快死亡為特征。1987年在美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)本病[1]。由于病原不明確，便稱為豬神秘?。⊿MD），另有藍(lán)耳病、藍(lán)色流產(chǎn)、豬不孕與呼吸綜合征（SIRS）等名稱[2]。現(xiàn)在已經(jīng)在大多數(shù)歐洲國(guó)家及部分亞洲國(guó)家發(fā)現(xiàn)，我國(guó)在1996年首先由郭寶清報(bào)告本病[3]。其造成豬的繁殖與呼吸障礙，給國(guó)內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)的動(dòng)物衛(wèi)生安全，對(duì)本病開展研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 病原學(xué)

PRRSV屬于套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬[4]。該病毒是一種直徑50～70 nm有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組序列已經(jīng)明確。對(duì)豬的肺泡巨噬細(xì)胞具有高度嗜性。PRRSV可分為2個(gè)亞群，即歐洲型（A亞群）和美洲型（B亞群）。由于PRRS的基因突變、病毒基因重組及連續(xù)的基因異變，加之病毒株之間的競(jìng)爭(zhēng)和免疫壓力選擇，PRRSV存在較大的基因變異，個(gè)別分離株的毒力、抗原性差異較大。我國(guó)發(fā)生的PRRS，經(jīng)全序列測(cè)序表明是美洲型。PRRSV對(duì)寒冷具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)高溫和化學(xué)藥品的抵抗力較弱。病毒在-70℃可保存18個(gè)月，4℃可保存1個(gè)月，37℃48 h，56℃45 min完全失去感染力，對(duì)乙醚和氯仿敏感。

2 臨床癥狀及病理變化

本病自然感染潛伏期一般為14 d。臨床表現(xiàn)為：母豬病初精神倦怠、厭食、發(fā)燒，妊娠中、后期發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎、產(chǎn)奶量下降、不發(fā)情或?qū)遗洳辉?。感染仔豬以2～28日齡的癥狀最為明顯，死亡率常達(dá)80%。早產(chǎn)仔豬多數(shù)24 h內(nèi)死亡，多表現(xiàn)為腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、后肢麻痹、打噴嚏、嗜睡、耳朵發(fā)紺。剖檢常見淋巴結(jié)不同程度出血和壞死變化，肺臟病變初間質(zhì)增寬呈水腫狀、之后出現(xiàn)瘀斑和實(shí)變，肝臟淤血、變性、腫大，脾臟腫大、出血性梗死，腎臟腫大、變性。育肥豬臨床癥狀不明顯，主要病變?yōu)殚g質(zhì)性肺炎。

近年來，本病發(fā)生后常繼發(fā)或并發(fā)一些病毒病或細(xì)菌病。趙國(guó)明等發(fā)現(xiàn)，PRRS可與豬偽狂犬病（PR）混合感染[5]。湯景元等從某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)送檢的3頭患病仔豬分離出了PRRSV和致病性沙門氏菌[6]。母安雄等根據(jù)豬群發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢查確診為豬流感并發(fā)PRRS[7]。陳紹柏也曾報(bào)道過豬藍(lán)耳病（PRRS）與豬瘟混合感染[8]。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

獸醫(yī)工作者和科研人員在原有的診斷方法的基礎(chǔ)上開發(fā)了很多的新的PRRSV的診斷技術(shù)，對(duì)PRRS的預(yù)防和及時(shí)治療具有重大的意義。

3.1 血清學(xué)檢驗(yàn)法

3.1.1 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)是目前常用的檢驗(yàn)血清中PRRS抗體的方法。微量滴定板加巨噬細(xì)胞，5%CO237℃孵育18～24 h，將含105TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染量）·mL-1的病毒懸液50μL加入每孔，5%CO237℃孵育18～24 h，棄去培養(yǎng)液，用鹽水沖洗培養(yǎng)板，置37℃干燥45 min后-20℃冷凍45 min。玻片上黏附的細(xì)胞用含4%多聚甲醛PBS處理，室溫放置10 min，鹽水沖洗。加入1∶10稀釋的被檢血清（稀釋用含4%馬血清和0.5%吐溫-80的0.2 M NaCl），37℃孵育1 h，沖洗。加入兔抗豬HRPO結(jié)合物50μL，封板37℃孵育1 h。顯色液/底物（AEC）染色鏡檢，血清內(nèi)存在抗體，則巨噬細(xì)胞胞質(zhì)被染成深紅色[9]。

3.1.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

有研究報(bào)道，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）取代IPMA，該方法敏感性、特異性和符合率均高于IPMA。法國(guó)已將ELISA作為檢測(cè)和診斷本病的常規(guī)方法。徐引弟等采用IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒對(duì)湖北、湖南、福建、浙江等省的大中型豬場(chǎng)豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）的流行情況進(jìn)行了血清學(xué)檢查，都檢查出了很高的陽(yáng)性率[10]。目前開發(fā)的試劑盒采用的歐洲型或美洲型病毒，或者采用這兩種抗原，具有迅速處理大批血清樣品的特點(diǎn)。

3.1.3 間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)

盡管現(xiàn)在無一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的公認(rèn)的免疫熒光檢測(cè)方法，但在北美洲的實(shí)驗(yàn)室研發(fā)出若干方案并已被采用。1～10周齡仔豬感染后7 d產(chǎn)生抗體，8 d IFA 滴度在 1∶20～1∶320，4周均為陽(yáng)性，滴度＞1∶2 560，而且大部分豬的抗體滴度至少為1∶1 280。尹訓(xùn)南等用IFA對(duì)人工接種PRRSV的8頭30日齡豬進(jìn)行體內(nèi)定位檢測(cè)，結(jié)果表明，特異性熒光細(xì)胞出現(xiàn)的頻度、數(shù)量及熒光度以肺臟最為明顯，特異性熒光主要出現(xiàn)在巨嗜細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中。值得關(guān)注的是，不同實(shí)驗(yàn)室IFA判斷標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有不同，在一定程度上檢測(cè)結(jié)果判定取決于所用的毒株。

3.2 PCR檢測(cè)方法

3.2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)法

有研究用RT-PCR建立一種直接檢測(cè)PRRS病毒的方法。以RT-PCR法擴(kuò)增從西班牙分離的7株病毒的312 bp片段，進(jìn)行克隆和測(cè)序，有96%～97%序列與PRRSV的核甘酸序列相同。有研究用PCR法能檢測(cè)出在細(xì)胞培養(yǎng)物中，或精液中30個(gè)感染單位（TCID）的PRRS病毒。Guarino等根據(jù)美洲株的（ATCCVR-2332）的ORFs4、6、7和Lelystad毒株的ORF1b設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，對(duì)來自美洲的24個(gè)PRRS病毒進(jìn)行了RT-PCR的擴(kuò)增，其中保守性強(qiáng)的ORF7基因檢出率為100%。Madsen等用RT-PCR方法對(duì)分離自丹麥某豬場(chǎng)的血清進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)病毒核甘酸序列ORF2-ORF7的分析發(fā)現(xiàn)，其序列與VR-2332序列的同源性為99.2%～99.5%，從而判定此株病毒是PRRSV的一種變異株[11]。徐宜強(qiáng)等參考國(guó)內(nèi)外已發(fā)表PRRSV的基因序列及相關(guān)的RT-PCR檢測(cè)方法報(bào)道，根據(jù)PRRSV高度保守、高特異性的NP蛋白基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了PRRSV RT-PCR檢測(cè)方法[12]。

3.2.2 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)

LAMP是由Notomi等發(fā)明的一種用于病毒檢測(cè)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其敏感、高效和便捷，被應(yīng)用到很多常見疫病的檢測(cè)[13]。鄧顯文等利用NSP2基因的RT-LAMP檢測(cè)方法，敏感性高于常規(guī)PCR10倍[14]。曾少靈等構(gòu)建的美洲型PRRSV及其高致病性變異株RT-LAMP檢測(cè)方法應(yīng)用檢測(cè)58份病料，其結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)符合率100%[15]。該方法操作簡(jiǎn)單且易于判定，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)開展檢測(cè)，但是其氣溶膠污染值需高度關(guān)注，應(yīng)做好檢測(cè)環(huán)境分區(qū)和定期通風(fēng)，避免假陽(yáng)性出現(xiàn)。

3.2.3 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，不依賴Ct值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目。其采取分析化學(xué)領(lǐng)域的微流控方法，將大量稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微反應(yīng)器中，每個(gè)反應(yīng)器的DNA模板數(shù)≤1個(gè)，這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，當(dāng)不存在任何靶標(biāo)序列時(shí)，沒有信號(hào)累積，進(jìn)而推算出原始溶液的DNA濃度。數(shù)字PCR為PRRSV酸檢測(cè)方面提供了新的檢測(cè)平臺(tái)，亟待利用該平臺(tái)構(gòu)建新的檢測(cè)方法。

4 防治

4.1 PRRS疫苗

近年來，PRRS的滅活苗、弱毒苗和基因工程苗的研究取得了很大的進(jìn)展，并通過合理的選擇和使用免疫佐劑，如γ干擾素，霍亂毒素及可溶性β-葡萄糖等來改進(jìn)疫苗的作用。Planadurán等報(bào)道，應(yīng)用西班牙毒株研制成一種滅活苗，對(duì)后備母豬和母豬進(jìn)行兩次免疫，有很好的保護(hù)作用[16]。滅活苗存在安全性，但是存在使用劑量大、成本高的問題。Schering-Plough公司發(fā)明了用于能繁母豬配種前3～6周使用的的弱毒苗[17]。弱毒疫苗在給豬群接種后，不僅可導(dǎo)致豬的病毒血癥，而且還可能通過分泌物向外排毒[18]。Clung等提出接種公豬可通過精液排毒[19]。更為嚴(yán)重的是，弱毒株的疫苗會(huì)發(fā)生返祖現(xiàn)象，轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)毒株，1996年丹麥弱毒苗免疫的豬群爆發(fā)PRRS[20]。因此，弱毒苗對(duì)PRRS陰性場(chǎng)、妊娠母豬、種公豬禁止使用。正因?yàn)槿醵久绾蜏缁蠲绱嬖谶@樣和那樣的問題，科研人員研發(fā)了采取腺病毒或偽狂犬病病毒為載體來表達(dá)PRRSV的主要免疫源性特性的多價(jià)基因工程苗和針對(duì)PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗及優(yōu)化的疫苗，為PRRS安全防控提供了新的技術(shù)手段。

4.2 飼養(yǎng)管理與環(huán)境控制

應(yīng)提高日糧營(yíng)養(yǎng)水平，保證維生素（VE，生物素）、礦物質(zhì)5%～10%（Fe、Ca、I、Se、Mn等）含量，注意氨基酸的平衡。保持環(huán)境衛(wèi)生，消毒徹底，防止PRRSV再次感染。注意保溫，當(dāng)溫度過低、過高、風(fēng)速大和紫外線照射強(qiáng)度過大時(shí)，PRRS傳染和傳播的幾率會(huì)增大。后備母豬和育成豬混合飼養(yǎng)，或者隔離不徹底，可能引起交叉感染。做好引種隔離、人員流動(dòng)控制和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，有助于預(yù)防本病。