飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的研發(fā)與應用

■蔡旺進 舒昊明 艾春香何小剛

（廈門大學海洋與地球學院，福建廈門 361005）

微生態(tài)制劑是指在微生態(tài)理論指導下，運用微生態(tài)學原理，利用對宿主有益無害的、活的微生物或微生物代謝產(chǎn)生的生物活性物質經(jīng)過特殊工藝制成的制劑，以達到調整機體微生態(tài)平衡的目的[1]。目前國際上已將微生態(tài)制劑分成3個類型，即益生菌、益生元和合生元。20世紀60年代，隨著長期或不規(guī)范的使用抗生素對養(yǎng)殖潛在危害的逐漸顯現(xiàn)，微生態(tài)制劑才在畜牧養(yǎng)殖中得到足夠重視[2]。直到90年代以后，水產(chǎn)養(yǎng)殖迅速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病瀕發(fā)，水產(chǎn)微生態(tài)制劑才逐步成為研究熱點[3]。水產(chǎn)微生態(tài)制劑首次報道應用于虹鱒（Oncorhynchus mykiss）與凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），隨后便在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛的應用[4-5]。水產(chǎn)微生態(tài)制劑主要分為飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑和調水改底用微生態(tài)制劑，具有凈化水質、改善水產(chǎn)品腸道微生物群落、提高消化吸收能力、促進動物生長、提高具體免疫相關基因的表達水平、增強機體抵抗病毒和細菌感染的能力[6-14]等功能。微生態(tài)制劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的促進作用的到了廣泛的認可，但由于起步時間晚，其在產(chǎn)品（特別是飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑）的研發(fā)與推廣應用仍處于初級階段。本文簡要概述飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑研發(fā)及其應用效果提升的技術關鍵，以期為其進一步完善、推廣使用提供參考。

1 研發(fā)飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的目的與意義

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、規(guī)范化、集約化和產(chǎn)業(yè)化程度的不斷提升，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，導致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物應激不斷增加、免疫力下降，疾病頻發(fā)，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害防治中抗生素濫用的現(xiàn)狀難以遏制。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中長期不規(guī)范使用的抗生素等化學藥物不僅增加病原菌的耐藥性，破壞水產(chǎn)動物的腸道菌群生態(tài)環(huán)境，也造成養(yǎng)殖環(huán)境抗生素超標；同時，殘留在養(yǎng)殖水產(chǎn)動物中的抗生素也會通過食物鏈富集作用進入人體，危害到人類的身體健康[15]。因此，尋找和研發(fā)更加安全可靠，能促進維持水產(chǎn)動物腸道菌群平衡、能減輕養(yǎng)殖自身污染、能協(xié)調人與自然的關系，符合可持續(xù)發(fā)展需要的抗生素等化學藥物的替代品是一個亟待解決的問題，其中，微生態(tài)制劑就是一種很好的抗生素替代品。

《飼料添加劑品種目錄（2013）》中規(guī)定，允許在飼料中添加的微生物有34種，其主要為芽孢桿菌、乳桿菌、酵母菌、雙歧桿菌、腸球菌、片球菌、鏈球菌等。益生菌的功能各異，如芽孢桿菌能分泌活性很強的酶，可有效提高飼料的利用率，促進水生動物生長，促進其他益生菌增殖[16]。乳桿菌能與病菌競爭定植部位，或通過分泌乳酸或揮發(fā)性脂肪酸，以減低定植環(huán)境pH值的方式抑制病原菌的生長[17]。益生元在宿主腸道內能被益生菌分解，進而被腸道吸收利用，其能選擇性增殖有益菌，直接或間接調節(jié)腸道微生物的組成[7，18]；果糖類益生元成分能直接幫助宿主對礦物質、維生素及抗氧化物的吸收[19]；此外，益生元亦能參與調節(jié)多種免疫參數(shù)（如NK細胞、淋巴細胞、多種細胞因子等）間接激活免疫系統(tǒng)[20]。自從益生元和益生菌引用入水產(chǎn)養(yǎng)殖以來，大量研究表明，無論是單一應用還是組合應用，其都對水生動物的健康有積極的作用，其中，多數(shù)研究則是揭示他們具有協(xié)同效應[21-23]。合生元集益生元的慢效保護性和益生菌的速效性于一體，能夠促進內外源有益菌在宿主腸道定植，調節(jié)宿主腸道微生物群落，激活宿主免疫系統(tǒng)，調節(jié)水體微生態(tài)環(huán)境，直接或間接的對水產(chǎn)動物提供保護作用[20]。飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑不僅可以提高飼料利用率，促進水產(chǎn)動物健康生長，而且有利于增強機體免疫力，減少疾病發(fā)生，從而降低藥物使用，這有助于保障水產(chǎn)品安全，維護養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境安全，推進水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色生產(chǎn)發(fā)展。

由于我國生產(chǎn)飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑企業(yè)多且雜，其標準和生產(chǎn)的微生態(tài)制劑品質不一；水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的多樣化以及微生態(tài)制劑使用的不規(guī)范，使其對水產(chǎn)養(yǎng)殖的作用無法得到明確體現(xiàn)，從而導致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者對微生態(tài)制劑的效果產(chǎn)生一定程度的質疑[24]。飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑優(yōu)點眾多，進一步開展其研發(fā)以及對其應用研究工作意義重大。

2 研發(fā)飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的技術關鍵

2.1 菌種的篩選與優(yōu)化

菌種選擇的首要原則是安全性，其次是功能性、高效性、穩(wěn)定性、易培養(yǎng)[25]。一般來說，作為水產(chǎn)飼用微生態(tài)制劑，其菌種必須符合以下6個條件：①對水產(chǎn)動物本身安全，即菌種病原性與毒副作用，要評價菌種、菌株是否存在抗性基因，是否產(chǎn)毒及其毒力因子（如毒素、侵襲和黏附因子等）的基因（包括基因識別、編碼的蛋白功能、同源百分比等），若存在編碼毒力因子的基因，可能需要進一步的表型實驗（例如細胞毒性試驗），且篩選的菌種、菌株不會與宿主體內病原微生物雜交；②菌種來源要考慮同源性和屬地化，菌種來源最好是宿主的土著菌群，菌株的同源性是指從水產(chǎn)動物腸道或水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離出來的菌，生產(chǎn)出來后再用回去，要能保證原有的性能不變，以免受排斥作用，也不影響原先的微生態(tài)平衡，以最大限度發(fā)揮其益生功能；菌種的屬地化則是指菌種要從本地分離獲得的，防止外來菌種的干擾；③易培養(yǎng)、繁殖快，競爭力強；④低pH值的環(huán)境（無機酸、有機酸和膽汁酸）條件下的活力強，并能穩(wěn)定定植在宿主腸道內；⑤能產(chǎn)抑制病原菌的物質（乳酸、過氧化氫等）；⑥易獲得、適應工業(yè)化生產(chǎn)且加工后存活率高，能穩(wěn)定存在于飼料中[26]；⑦功能要明確、作用機理較為清晰。此外，要使飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑在水產(chǎn)配合飼料生產(chǎn)中能真正使用，菌種應該在高溫高濕高壓的加工環(huán)境條件下保持較高的存活率。飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種篩選主要流程：收集菌株研究背景資料，菌株的獲得，菌株致病性與安全性的評估，菌株功能性和有效性的評估，菌株對外源致病菌株抑制能力的評估，商業(yè)價值的分析及菌株發(fā)酵特性分析[27]，產(chǎn)品質量標準建立。

安全性分析與風險評價是菌種篩選是否符合標準的先決條件，其次菌種的適應宿主腸道環(huán)境的能力也應作為一個重要的篩選指標，如是否耐酸、膽鹽和胰蛋白酶等。除此之外，飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑加工成飼料還需經(jīng)過干燥、運輸?shù)炔襟E，這些因素也會造成益生菌大量的死亡。綜合上述各種因素，其結果是：乳桿菌、片球菌、雙歧桿菌等產(chǎn)乳酸類的細菌應主要用于預防水產(chǎn)養(yǎng)殖動物患疾用；芽孢桿菌、酵母菌等主要用于提高水產(chǎn)動物的生長速率及飼料利用率[28]。

目前，除從水體環(huán)境和水產(chǎn)動物本身分離、培養(yǎng)獲得有益菌菌種、菌株外，還可以利用分子生物學手段剔除微生物中無益或有害的基因以獲得高效表達對宿主有益產(chǎn)物的微生物菌種、菌株；將其他物種的耐高溫、抗酸等功能基因整合或者插入到微生物基因中，以獲得具有耐高溫、抗酸等新功能的菌種、菌株，這不僅有利于菌種、菌株在宿主體內存活，也有利于抵抗飼料加工帶來的不利影響。分子生物學技術在菌種篩選與菌種品質改良方面發(fā)揮著重要作用[29]。同時，高空輻射等的強致突變的特殊環(huán)境也可用來提高菌種突變率以快速篩選優(yōu)良菌種[30]。然而，通過基因改造或突變的菌種往往存在抗性質粒轉移到病原菌或其他生物上的風險，造成大量不同生物及其后代具有抗藥性。因此，對改造菌種的檢測與控制必須十分嚴格。

2.2 復合菌種搭配

益生菌的合理配伍是研發(fā)更高效飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑一個重要的途徑。微生態(tài)制劑只含有單一菌種而缺少多種有益菌的協(xié)同互補作用，常常表現(xiàn)出使用效果不明顯，且不同的水產(chǎn)動物的使用效果差別較大等問題。復合菌劑能適應多種不同的環(huán)境和宿主，其比單一菌劑更能促進機體的生長和提高食物轉化率，并能在一定程度減少疾病的發(fā)生[31-32]。微生態(tài)制劑產(chǎn)品中采用的復合菌種，應根據(jù)動物種類、年齡階段、腸道菌群狀態(tài)、水產(chǎn)動物的生理狀態(tài)等進行配方優(yōu)化組合，充分發(fā)揮不同益生菌的優(yōu)良作用，實現(xiàn)優(yōu)勢互補作用。飼用微生態(tài)制劑配方應是厭氧菌和兼性厭氧菌共存的復合制劑，以保證產(chǎn)品對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的作用效果顯著。通過配伍試驗可以確定最佳的復合菌劑組合，試驗過程包括：種子菌液制備、初篩和多菌種配伍篩選。多菌種篩選試驗分別以其中一種確定的菌種和物質的含量作為指標，通過兩菌種、三菌種和四菌種等配伍試驗來確定最佳的配伍組合[3]。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化與控制

傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝包括液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵這兩種工藝。液體深層發(fā)酵是將微生態(tài)制劑目標微生物接種于生物反應器中進行深層液體培養(yǎng)，得到發(fā)酵好的菌體可以直接作為微生態(tài)制劑成品，也可通過過濾、濃縮、吸附、干燥等加工工藝制成菌劑[33]。液體深層發(fā)酵的液體懸浮狀態(tài)是大多微生物最適宜的狀態(tài)，其具有易于檢測、控制、運輸和產(chǎn)出質量濃度高的產(chǎn)品等優(yōu)點。液體深層發(fā)酵也具有一些缺點，研究表明，深層發(fā)酵培養(yǎng)菌株的芽孢活力低[34]。液體深層發(fā)酵目前應用廣泛，技術也相對成熟，對該發(fā)酵工藝的優(yōu)化主要集中在對不同菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化與處理菌株時保護手段。固體發(fā)酵是指在體系無水或者接近無水的固態(tài)支持底物下進行微生物的發(fā)酵培養(yǎng)[35]。固體發(fā)酵工藝具有成本低，酶系豐富，菌量大等優(yōu)點，但工藝生產(chǎn)周期長，發(fā)酵不均勻和機械化程度低等缺點制約著該工藝的發(fā)展。因此，對其優(yōu)化主要集中于發(fā)酵的設備升級與檢測的手段突破等[33]。液固兩相發(fā)酵工藝是結合液體與固體發(fā)酵兩大手段，先利用液體深層發(fā)酵以獲得大量菌體，再放置于固體發(fā)酵罐中進行接近自然狀態(tài)的固體發(fā)酵[36]。該發(fā)酵工藝同時具有上述兩者優(yōu)點，但也存在的一些問題，如發(fā)酵產(chǎn)物從液體轉移到固體的過程容易染菌，菌體在兩種狀態(tài)過渡的過程可能會影響菌體的生長[32]。

3 飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑應用效果提升的關鍵

3.1 飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑應用的研究成果與現(xiàn)狀

隨著飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑應用于虹鱒與凡納濱對蝦見報道后，其對一些其他經(jīng)濟魚類，如大黃魚(Larimichthyscrocea)、軍曹魚(Rachycentroncanadum)和甲殼動物，如歐洲龍蝦(Homarusgammarus)、日本對蝦(Penaeusjaponicus)等的作用的文章也相繼發(fā)表[37-40]。2012年以來，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的養(yǎng)殖得到爆發(fā)式的發(fā)展，尤其是在探究益生元與益生菌的配伍優(yōu)化對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長性能、存活率、免疫應答、抗病能力、腸道健康等方面的應用研究。其中，大量研究集中于虹鱒魚，包括：MOS與滅活糞腸球菌(Enterococcus faecalis)配伍能顯著提高其生長表現(xiàn)與免疫應答[41]，GOS與乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)配伍能有效提高其生長表現(xiàn)、存活率、腸道菌群、免疫能力和抗病能力[42-43]。微生態(tài)制劑對養(yǎng)殖魚類，如斑馬魚(Brachydaniorerio)、三角魴(Megalobramaterminalis)、羅非魚(Oreochromisniloticus)，觀賞魚類，如日本錦鯉(Cyprinuscarpio)、神仙魚(Pterophyllumscalare)；甲殼動物，如凡納濱對蝦、歐洲龍蝦；軟體動物，如耳鮑(Haliotis Asinine)等的益生促進作用也得到廣泛的研究[44-53]。近年來對水產(chǎn)微生態(tài)制劑的研究雖然呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的趨勢，但其中仍存在許多問題。飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑面臨許多問題：①沒有自主篩選的菌種及保藏技術，導致菌種退化嚴重；②菌種較為單一，缺乏多菌種配伍以形成的協(xié)同效應；③通用型的微生態(tài)制劑在市場占有絕大多數(shù)市場，針對性不強，效果不穩(wěn)定；④制成工藝較為落后，導致實際的活菌數(shù)量較低；⑤添加量不夠，不能達到應有的效果；⑥飼料加工、運輸和貯存中，菌株活性下降；⑦片面夸大微生態(tài)制劑的作用等等。

3.2 飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑應用效果提升的宏觀對策

3.2.1 建立飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種篩選、生產(chǎn)技術規(guī)范以及規(guī)范科學的產(chǎn)品標準，保障產(chǎn)品質量

飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的核心因素是菌種，是否能篩選出良好的菌種是決定微生態(tài)制劑產(chǎn)品質量的重要保證[54]。這要求從業(yè)者在不斷提升飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑質量的過程中必須扣好“菌種篩選”這第一顆紐扣，即建立標準的菌種篩選過程，其中，除首先確保菌種的安全性這一個不可或缺的菌種特性外，明確菌種的來源、種屬、穩(wěn)定性、抗逆性等都應該提到首位。

微生態(tài)制劑的制作對生產(chǎn)技術和生產(chǎn)的工藝要求很高。目前，我國400多家微生態(tài)制劑企業(yè)中，大多數(shù)不具有生產(chǎn)高質量微生態(tài)制劑的能力，導致現(xiàn)階段市場上的微生態(tài)制劑品質良莠不齊，有的甚至同一品牌的不同批次產(chǎn)品都無法保持穩(wěn)定[55-56]。目前相關的微生態(tài)制劑標準有兩個通用標準，即國家標準《微生物飼料添加劑通用要求》(GB/T 23181—2008)和農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《微生物飼料添加劑技術通則》（NY/T 1444—2007），這顯然無法滿足種類繁多的微生物[56]。在這種形勢下，市場與政府必須通力協(xié)同合作，加快制定通用及多種具針對性的科學的生產(chǎn)技術規(guī)范與科學的產(chǎn)品標準以改善與規(guī)范現(xiàn)今混亂的微生態(tài)制劑市場。

3.2.2 建立飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑在水產(chǎn)配合飼料生產(chǎn)過程中的應用技術規(guī)程，提升其使用效果

飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑應用于水產(chǎn)配合飼料的加工過程中存在高溫、高濕、高壓等對益生菌類可致死的因素，多數(shù)企業(yè)不具備解決該技術難題的力量，導致市場上多數(shù)含有微生態(tài)制劑的水產(chǎn)配合飼料出現(xiàn)效果差，效價不明等的問題。市場上已經(jīng)存在許多應用手段，如后噴涂工藝的應用、微膠囊包埋技術、低溫膨化技術、篩選耐高溫高濕菌株等。這些技術作用的效果或高或低，技術難度與成本也不盡相同，建立微生態(tài)制劑應用于水產(chǎn)飼料生產(chǎn)過程的應用技術規(guī)程，規(guī)定生產(chǎn)過程最低與最能廣泛應用的方法，是保證與提升微生態(tài)制劑使用效果的基礎與最有效的措施。

3.2.3 建立飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑規(guī)范科學的效果評價技術體系

飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑與抗生素等化學藥品區(qū)別在于其防重于治、對環(huán)境友好。這些特點衍生出了一些亟待解決的問題，即“防”是一個持續(xù)的過程，并不能在很短時間體現(xiàn)出顯著的效果，如何評價其對水產(chǎn)養(yǎng)殖有促進作用。同時，有些企業(yè)自身都無足夠的資質對自家的產(chǎn)品作評價，有些企業(yè)以死菌數(shù)以冒充活菌數(shù)，這也導致了從供給側方面沒有足夠有效的、可靠的數(shù)據(jù)支持[56]。上述的多種因素導致水產(chǎn)養(yǎng)殖戶對飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖的促進效果提出質疑。針對這種現(xiàn)象，企業(yè)內部改革升級是解決最根本的措施，雖然當下沒有統(tǒng)一的標準，但提高企業(yè)的品牌形象，將企業(yè)做好做實，這對企業(yè)是否能持續(xù)的發(fā)展具有重要意義。同時，政府、企業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖戶應協(xié)同推進制定科學的飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑效果評價體系，從實踐中來，再到實踐中去，不斷完善評價體系，這不僅能提升飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的應用推進，也是提升微生態(tài)制劑產(chǎn)品升級的重要措施。

3.2.4 建立含飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的水產(chǎn)配合飼料的科學使用技術規(guī)范

解決由生產(chǎn)水平導致的微生態(tài)制劑作用效果不夠的問題是一個漫長的過程，不可能一蹴而就。而面對現(xiàn)有微生態(tài)制劑產(chǎn)品，建立含飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑的水產(chǎn)配合飼料的科學使用技術規(guī)范，指導水產(chǎn)養(yǎng)殖戶對其合理的使用顯得尤為重要，如：“先入為主”的理論應該被重視，通過益生菌的先入定殖可以降低病原菌的定居；微生態(tài)制劑的使用是一個持續(xù)的預防過程，效果的體現(xiàn)是一個漸變的過程；無法確定活菌數(shù)時，應不斷調整微生態(tài)制劑的使用量以到達應有效果等。

3.3 飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑在水產(chǎn)配合飼料生產(chǎn)過程中技術加工升級

飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑在水產(chǎn)配合飼料生產(chǎn)過程中技術加工升級包括：后噴涂工藝的應用、微膠囊包埋技術、低溫膨化技術等。

為了減少飼料的中熱敏物質及菌株的損失，微囊化處理與耐高溫菌劑開發(fā)等方法相繼提出。然而成本的提高帶來較大的局限性，而真空后噴涂技術很好解決成本問題。真空后噴涂技術是利用壓力差的原理，在無微生態(tài)制劑的成型飼料表面抽真空，利用壓力差將噴涂在飼料表面的微生態(tài)制劑滲入飼料顆粒內部，使其均勻分布于飼料中，解決了傳統(tǒng)后加工工藝高溫高濕等外界不利因素而導致的微生態(tài)制劑配方失真。同時真空也能抽出顆粒內部空氣，以達到吸收更多微生態(tài)制劑的效果[57]。微囊化包囊技術是將微生態(tài)制劑中成分包被于微膠囊中，保證活菌在加工過程中的活力與存活時間，保證其到達適當?shù)沫h(huán)境下后釋放、發(fā)揮其作用[58]。微膠囊包埋技術是保持益生菌的活力的最實用和最有效的方法之一[59]。低溫膨化技術是利用液壓氣化原理將微生態(tài)制劑制成飼料過程的溫度降到熱敏菌可接受的范圍，一般可以與噴涂技術混合使用。

4 結語

飼用水產(chǎn)微生態(tài)制劑具有安全、質量可控和環(huán)境友好等優(yōu)點，是促進養(yǎng)殖水體生態(tài)文明建設的更進一步，符合新時代水產(chǎn)養(yǎng)殖的觀念。由于我國微生態(tài)制劑的研發(fā)與應用起步晚，菌種單一，制作工藝原始等問題將長期存在。隨著科技的不斷進步，專一性與高效性是今后微生態(tài)制劑研發(fā)的發(fā)展趨勢；水產(chǎn)微生態(tài)制劑研發(fā)與應用的升級將是近期的一個重要議題?？傊?，微生態(tài)制劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖所取得的成果不可撼動，其今后的發(fā)展必將突飛猛進。