外泌體及其microRNA與缺血性腦卒中關(guān)系的研究進展

胡琳，何圣佳，陳翠花，鄒利，孫延鵬，王云甫

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院第一臨床學(xué)院，湖北十堰442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院)

腦卒中已成為人類病死率和致殘率最高的疾病，其中80%～90%腦卒中為缺血性腦卒中[1]。腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦組織缺血導(dǎo)致細(xì)胞損傷，恢復(fù)血流再灌注后，腦細(xì)胞損傷進一步加重，具體機制可能與再灌注時氧自由基通過脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、線粒體凋亡以及死亡受體的激活等相關(guān)，該類損傷可進一步導(dǎo)致腦組織損傷加重和神經(jīng)功能障礙，甚至神經(jīng)細(xì)胞死亡。發(fā)現(xiàn)不同階段新型特異損傷標(biāo)志物[2]，調(diào)控和修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞以及促進腦血管再生，成為目前診療的重要突破口。外泌體是一種特異性細(xì)胞外囊泡，其表面蛋白分子及其內(nèi)的外泌體是大多數(shù)細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的一種膜性囊泡，直徑40～100 nm，通過其表面特殊分子熱休克蛋白(HSP70)、Alix、白細(xì)胞分化抗原68(CD68)及內(nèi)部蛋白、微小RNA(microRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、DNA等發(fā)揮細(xì)胞間信息交流、靶向運輸、調(diào)控靶細(xì)胞功能等重要作用[3]。近年來越來越多的研究表明，細(xì)胞在不同應(yīng)激狀態(tài)下分泌的外泌體有其特征及作用，并可作為損傷標(biāo)志物動態(tài)評價CIRI[4]。外泌體本身作為可靠有效的載體，實現(xiàn)了藥物的靶向遞送，并參與了腦血管損傷修復(fù)，進而減輕CIRI，同時外泌體內(nèi)的microRNA、lncRNA也參與調(diào)節(jié)靶細(xì)胞[5,6]。目前其在心腦血管疾病中作為損傷標(biāo)志物、藥物靶向治療載體、調(diào)節(jié)受損細(xì)胞功能等方面作用顯著，同時也有研究發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的microRNA可以作為組織缺血不同階段的新型標(biāo)志物。本文對外泌體及其microRNA在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展、治療中的作用作一綜述。

1 外泌體與缺血性腦卒中的關(guān)系

1.1 外泌體與腦血管修復(fù)、再生的關(guān)系 CIRI過程中由于血管通透性改變導(dǎo)致局部白細(xì)胞游走滲出，局部炎癥反應(yīng)將進一步加重腦組織損傷。近年來CIRI后腦血管修復(fù)、再生成為研究熱點。體內(nèi)外相關(guān)實驗證實內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠分泌參與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路相關(guān)microRNA的外泌體，亦能夠分泌參與前血管生成的microRNA外泌體，如miR-126和miR-296，從而使內(nèi)皮細(xì)胞通過激活PI3K/Akt信號通路參與內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)與再生[7,8]。Xu等[9]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元通過分泌含有miR-132的外泌體作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞中Eef2k基因，通過抑制Eef2k基因的表達從而上調(diào)Cdh5分子表達，增強了血管完整性。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤來源的外泌體通過釋放前血管生成蛋白、mRNAs、microRNAs，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，同樣其在CIRI過程中也發(fā)揮相同的作用。除此之外，血管內(nèi)皮細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)時會釋放含有血管內(nèi)皮生長因子B(VEGF-B)mRNA的外泌體，而后外泌體被已經(jīng)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞，增強受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達，最終修復(fù)了受損的內(nèi)皮細(xì)胞[10]，促進血管修復(fù)。在心肌缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)miR-223-3p通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶Β1/氧誘導(dǎo)因子1α信號通路抑制了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)[11]，這一現(xiàn)象在腦缺血的過程中如果同樣存在，將具有重要意義，具體機制值得進一步研究[7,12]。

腦卒中發(fā)生后，缺血半暗帶的面積大小與腦血管的完整性存在一定關(guān)聯(lián)。減小缺血半暗帶面積及修復(fù)損傷血管對腦卒中的復(fù)發(fā)及患者預(yù)后發(fā)揮重要作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體中microRNA對受損血管結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)及血管修復(fù)發(fā)揮重要作用；外泌體參與CIRI后血管修復(fù)和再生，其涉及的機制比較復(fù)雜，有待進一步研究證實。

1.2 外泌體與神經(jīng)修復(fù)、再生的關(guān)系 室管膜下的神經(jīng)干細(xì)胞與周圍神經(jīng)細(xì)胞及與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的交流使得其內(nèi)信號通路的激活處于持續(xù)動態(tài)變化之中，有向各種細(xì)胞分化的趨勢，于是越來越多的研究趨向于研究室管膜下的神經(jīng)干細(xì)胞不同分化方向的信號通路[13]。研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體及腦脊液內(nèi)的外泌體通過調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的信號通路，從而參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的功能及免疫反應(yīng)[14]。通過分析大鼠及人腦脊液外泌體發(fā)現(xiàn)，該類外泌體內(nèi)含有胰島素樣生長因子信號通路中關(guān)鍵的蛋白和相關(guān)microRNA，此類外泌體調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的分化，這一潛在的機制將為臨床診療帶來新思路[14]。此發(fā)現(xiàn)將為腦缺血發(fā)生后誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞進而替代死亡的神經(jīng)元細(xì)胞提供了新思路。又有研究發(fā)現(xiàn)，利用促炎性細(xì)胞因子體外刺激神經(jīng)干細(xì)胞，可促進神經(jīng)干細(xì)胞分泌富含microRNA的外泌體，通過作用血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶基因，上調(diào)了γ-干擾素的水平，進一步激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善了受損神經(jīng)元細(xì)胞的活性[15]。腦缺血時離子型谷氨酸受體(NMDA)的過表達可加重神經(jīng)元損傷[16]。研究表明，外泌體中的miR-233調(diào)控NMDA亞基的功能亞單位GluR2和NR2B3′-UTR基因的表達，其通過作用GluR2和NR2B基因3′-UTR的操縱序列而抑制GluR2和NR2B基因表達，進一步抑制NMDA的受體表達，可減少NMDA所介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流。由此推斷，上調(diào)miR-233表達可以抑制NMDA的表達，阻止Ca2+過度內(nèi)流，從而減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載所引發(fā)的神經(jīng)元損傷，進一步減輕缺血區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞損傷[17]。因此缺血事件發(fā)生后，外泌體內(nèi)microRNA對神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)以及神經(jīng)元細(xì)胞再生有重要意義[18]。

大腦對缺血缺氧的耐受能力較差，在相應(yīng)的供血動脈阻塞后，神經(jīng)元細(xì)胞很快發(fā)生不可逆的壞死和凋亡。如今越來越多的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體在減輕缺血事件發(fā)生后神經(jīng)元細(xì)胞不可逆性壞死和凋亡方面發(fā)揮重要作用[19]。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)的缺血再灌注損傷體內(nèi)外細(xì)胞模型研究中，HUVECs衍生的外泌體參與調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清及血清中高表達內(nèi)皮細(xì)胞來源的含CD63、HSP70、腫瘤易感基因101蛋白的外泌體，而SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)分子caspase-3、Bax和Bcl-2表達降低。因此推測HUVECs衍生的外泌體可能通過調(diào)控凋亡信號通路中的相關(guān)信號分子，抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，并最終減輕缺血后損傷[20]。研究表明，在急性缺血性腦卒中梗死區(qū)域周圍，在應(yīng)激刺激下神經(jīng)元軸突開始再生，但同時其也被星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的瘢痕所抑制[21]。在大腦中動脈栓塞大鼠模型中，通過抑制軸突生長過程中的神經(jīng)元信號傳導(dǎo)和利用氧-葡萄糖缺乏來培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體通過增加前列腺素D2合酶表達而促進軸突再生。因此無論外泌體直接減輕缺血后神經(jīng)元細(xì)胞損傷或參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞軸突的損傷修復(fù)、再生，都給損傷后細(xì)胞的自我修復(fù)機制提供了新的思路和研究方向。

2 外泌體攜帶的microRNA與缺血性腦卒中的關(guān)系

近年來通過外泌體的基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，外泌體參與CIRI的整個發(fā)生發(fā)展過程中，其內(nèi)部的microRNA作為潛在的損傷標(biāo)志物具有重要意義[22]。在一項大樣本的病例對照研究中，通過提取72 h內(nèi)急性腦卒中患者血液中外泌體內(nèi)的microRNA后測序分析，發(fā)現(xiàn)病例組中miR-133表達高于對照組，同時與美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表評分具有高度一致性。miR-133可作為缺血性腦損傷的潛在標(biāo)志物，在CIRI中具有重要意義[23]。對腦卒中患者血液循環(huán)中外泌體內(nèi)的miR-335和鈣調(diào)蛋白(CaM)研究發(fā)現(xiàn)，miR-335表達下調(diào)與血漿中CaM表達升高密切相關(guān)，預(yù)示著miR-355與CaM之間存在著負(fù)反饋調(diào)節(jié)關(guān)系[24]。同時越來越多的證據(jù)表明，抑制鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶(CaMKK)信號通路會減輕CIRI，因此通過上調(diào)循環(huán)中的miR-335表達進而靶向作用CaMKK通路減輕CIRI[25]。在大鼠CIRI模型中發(fā)現(xiàn)[26]，外周循環(huán)外泌體內(nèi)的miR-122能夠改善大鼠預(yù)后，也能夠下調(diào)靶細(xì)胞中MmP8、Timp3、Alox5、Itga2b等基因的表達，同時以上基因參與了白細(xì)胞滲出及黏附、花生四烯酸的生成以及動脈粥樣硬化的形成，從而參與腦卒中整個發(fā)生發(fā)展過程。miR-122為腦卒中患者細(xì)胞內(nèi)分子治療提供了新思路。進一步研究外泌體內(nèi)microRNA的作用靶點、分子調(diào)控機制以及特異性分子標(biāo)志物，將會為腦血管疾病的診療帶來新的突破。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來源的外泌體在缺血性腦卒中治療中的作用

MSC在腦卒中治療中發(fā)揮積極作用，同時MSC治療腦卒中目前已經(jīng)處于臨床實驗階段[27]。研究表明，MSC能夠在細(xì)胞因子刺激下啟動相關(guān)信號通路，促進腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞及血管再生[28]。亦有研究表明，MSC通過分泌相關(guān)外泌體將其功能蛋白、mRNA、microRNA分子轉(zhuǎn)運到遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞，通過增強或抑制受體細(xì)胞胞內(nèi)相關(guān)分子的表達發(fā)揮作用[29]。MSC也可通過促進施萬細(xì)胞分泌神經(jīng)血管因子以促進神經(jīng)生長，同時研究發(fā)現(xiàn)MSC也可轉(zhuǎn)化為施萬細(xì)胞[30]。內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體能有效增加間充質(zhì)干細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-3和核因子κB活性而促進MSC的增殖、遷移和分泌[19]。MSC來源的外泌體在腎損傷、肝損傷、心肌缺血再灌注損傷、腦缺血治療中發(fā)揮作用[31]，其機制可能為通過修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而增強血管的完整性，最終減輕缺血再灌注損傷。同時其他干細(xì)胞來源的外泌體參與腦缺血過程的相關(guān)研究也越來越多[32]。

眾所周知，基因治療能夠從本質(zhì)上解決腫瘤、腦卒中等疾病，但由于目前在質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及體內(nèi)靶向性上存在精準(zhǔn)性問題。外泌體被認(rèn)為是體內(nèi)基因靶向遞送的良好載體，被靶細(xì)胞內(nèi)吞后，其所攜帶的基因?qū)诎屑?xì)胞內(nèi)發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)[29]。Katakowski等[33]研究表明，MSC源性外泌體含有miR-146b，其被膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)吞后，抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，并且較小劑量的外泌體miR-146b就可抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長，改變其表型。與此同時，在另外一項大鼠的腦缺血研究中，通過缺血區(qū)域注射MSC來源含miR-133b的外泌體到缺血大鼠腦內(nèi)，一段時間后大鼠腦內(nèi)缺血部位神經(jīng)元可塑性得以明顯提高[34]，提示MSC來源的外泌體內(nèi)的相關(guān)分子進入神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮了潛在作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-133b能夠作用于靶基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)和ras基因家族A，當(dāng)缺血性損傷發(fā)生后，miR-133b使缺血區(qū)域的CTGF表達減少，從而減輕了缺血區(qū)域的炎癥反應(yīng)[35]，同時又在腦缺血模型的小鼠體內(nèi)靜脈注射MSC來源的外泌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)域的突觸核蛋白含量和突觸的密度明顯高于對照組。除此之外，發(fā)現(xiàn)缺血區(qū)域的微管相關(guān)蛋白和血管生長因子含量明顯增加。MSC來源的外泌體將會為腦卒中的細(xì)胞療法帶來新思路。

多項研究指出，MSC來源的外泌體參與調(diào)控受損神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，在腦卒中的治療中發(fā)揮重要作用；同時也部分揭示了MSC參與腦卒中治療的細(xì)胞學(xué)機制，這將會為臨床MSC治療腦卒中的具體分子調(diào)控機制帶來新思路。

腦卒中的預(yù)防和治療已經(jīng)成為全世界關(guān)注的問題，合理預(yù)防以及有效治療是提高腦卒中患者預(yù)后的重要策略。外泌體及其內(nèi)部microRNA作為新一代細(xì)胞與細(xì)胞之間交流的信使，參與腦卒中發(fā)生后神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及修復(fù)。近年來MSC及其分泌的外泌體用于治療腦卒中也取得重大進展。越來越多的證據(jù)顯示,外泌體及其內(nèi)的microRNA參與了CIRI的整個病理生理過程。一個microRNA在體內(nèi)有很多作用位點，并且多個microRNA可作用同基因位點。外泌體內(nèi)microRNA作為新型生物標(biāo)志物在腦缺血再灌注不同的階段發(fā)揮不同作用，同時外泌體及其內(nèi)microRNA在缺血性腦卒中的診療中有優(yōu)勢。與此同時，MSC來源的外泌體在腦缺血動物模型上治療已經(jīng)取得突破。未來，外泌體及其microRNA參與受損血管結(jié)構(gòu)和受損神經(jīng)元修復(fù)的具體機制會進一步闡明，外泌體搭載藥物靶向治療腦卒中也將會取得突破，這將為腦卒中患者的治療和預(yù)后帶來新的希望。