正交設(shè)計優(yōu)選葛根超聲加熱提取工藝※

郭愛靈姚斯琪姚 濤潘斯慶周劉華常躍興*

（1 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽 淮南 232001；2 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)前沿實驗中心，安徽 淮南 232001）

在醫(yī)藥工業(yè)大生產(chǎn)中葛根提取率直接影響其資源利用率，制劑生產(chǎn)效率及經(jīng)濟效益［1］。葛根提取技術(shù)見于報道的有傳統(tǒng)浸提法［2］、煎煮法、加熱回流法［3-4］、半仿生提取法［5］、微波輔助提取法［6］、超聲波輔助提取法［7］、超聲波-微波輔助提取法［8］，以及用超聲波和熱回流聯(lián)合提取法等［9］。前期實驗表明，可采用超聲波輔助提取法替代加熱回流法對野葛樣品進(jìn)行處理［10］。本文進(jìn)一步采用超聲加熱提取方法，以主要活性成分葛根總黃酮和葛根素（puerarin，1）［11］含量為指標(biāo)，對該提取工藝參數(shù)進(jìn)行單因素考察和正交設(shè)計優(yōu)選，以探討葛根最佳提取工藝。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）；Plus C 18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）；UV1902型紫外可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；KQ-100 DE型超聲波清洗器（工作頻率為40 kHz，最大超聲功率為100 W，昆山超聲儀器有限公司）；MS105DU型十萬分之一天平（梅特勒托利多國際貿(mào)易有限公司）；BSM 220.4型分析天平（上海精卓電子科技有限公司）；DE-100 G型多功能小型粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）。甲醇（色譜純，美國Merk公司）；水（超純水）；葛根（采自于安徽省蕪湖市蕪湖縣境內(nèi)山坡，趁鮮切成 5 μm見方的小塊，干燥備用，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為豆科植物野葛 Pueraria lobata (Willd.)Ohwi的干燥根）；葛根素對照品（批號為110752-201514，供含量測定用，購于中國藥品生物制品檢定研究院）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素考察 根據(jù)中藥提取原理及其影響因素，本文首先以總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）為指標(biāo)選取超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度以及液料比對皖南野生葛根超聲加熱提取工藝單因素進(jìn)行考察?？傸S酮提取率（%） 和葛根素提取率（%） 采用文獻(xiàn)［4］報道的方法，經(jīng)方法學(xué)驗證均符合含量測定要求。

2.1.1 超聲溫度 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1加入 60% 乙醇，浸泡30 min后分別在設(shè)定加熱溫度為 15，30，45，60℃ 下，超聲提取 30 min。提取液自然冷卻以60%乙醇補足損失的重量，振搖后過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液適量稀釋后在250 nm吸收波長處測定吸光度，并代入回歸方程計算總黃酮含量；取續(xù)濾液1 mL置于10 mL容量瓶，以20%乙醇定容至刻線，振搖，在2.1項色譜條件下進(jìn)樣20 μL，代入回歸方程計算葛根素含量。結(jié)果如圖1a所示。

圖1 超聲溫度對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

從圖1a可見，隨著超聲溫度的增加，總黃酮提取率呈增加趨勢，而葛根素提取率在45℃時最高；提取溫度30℃以下對總黃酮提取率影響不大，30℃以后隨溫度增加總黃酮提取率增幅較大，而提取溫度對葛根素提取率增幅影響不大。

2.1.2 超聲時間 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1加入60%乙醇，浸泡30 min后在設(shè)定加熱溫度為 45℃ 下分別超聲提取 15，30，45，60 min。提取液后續(xù)處理及含量測定同2.2.1項下操作，結(jié)果如圖1b所示。從圖1b可見，隨著超聲時間的延長，總黃酮和葛根素提取率均有增加的趨勢，且增幅變化較大，而超聲時間對總黃酮提取率比對葛根素提取率提高較為顯著。

圖2 超聲時間對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.3 乙醇濃度 精密稱取5 g葛根備用藥材，按照液料比為10∶1分別加入20%，40%，60%，80%乙醇，浸泡30 min后在設(shè)定加熱溫度為45℃下超聲提取60 min。提取液后續(xù)處理及含量測定同2.2.1項下操作，結(jié)果如圖1c所示。從圖1c可見，乙醇濃度對總黃酮和葛根素提取率及其增幅均有較大，且總黃酮和葛根素提取率在60%處均出現(xiàn)最大值。

圖3 乙醇濃度對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.4 液料比 精密稱取5 g葛根備用藥材，分別按照液料比為 5∶1，10∶1，20∶1，40∶1 加入 60% 乙醇，浸泡 30 min后在設(shè)定加熱溫度為45℃下超聲提取60 min。提取液后續(xù)處理及含量測定同2.2.1項下操作，結(jié)果如圖1d所示。從圖1d可見，隨著提取溶劑與藥材比例的增加，總黃酮和葛根素提取率均有先增加后減小的趨勢，且在液料比10∶1處出現(xiàn)最大值。

圖4 料液比對皖南野葛中總黃酮及葛根素提取率的影響

2.1.5 單因素考察極差分析 以不同水平為考察指標(biāo)，對各單因素不同水平總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）最大值與最小值之差，即極差進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

表1 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝單因素考察極差分析(%)

從以上結(jié)果分析，超聲溫度對總黃酮提取率（%）和 1提取率（%）影響均最大，以總黃酮提取率（%）為指標(biāo)，四因素影響大小順序為超聲溫度＞超聲時間＞乙醇濃度＞液料比；以葛根素提取率（%）為指標(biāo)，四因素影響大小順序為超聲溫度＞乙醇濃度＞超聲時間＞液料比。

2.2 正交實驗設(shè)計 為優(yōu)選皖南野生葛根超聲加熱提取工藝，根據(jù)正交試驗設(shè)計方法原則和單因素實驗考察結(jié)果，分別設(shè)定超聲溫度 30，45，60℃，超聲時間30，45，60 min，乙醇濃度 40%，60%，80%，液料比5∶1、10∶1、20∶1，四因素三水平選用（L934）表進(jìn)行實驗，因素水平表見表2。

表2 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝正交設(shè)計

2.2.1 正交試驗極差分析 9次實驗總黃酮提取率（%）、葛根素提取率（%）實驗結(jié)果，以及采用 SPSS 23.0軟件處理所得極差分析結(jié)果均見表3。

表3 皖南野生葛根超聲加熱提取工藝正交實驗極差分析結(jié)果

從表3極差分析結(jié)果看出，乙醇濃度對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響均最大，直觀分析以總黃酮提取率（%）為指標(biāo)最佳提取工藝為C1A3B3D2，四因素影響大小順序為 C＞A＞B＞D；以葛根素提取率（%）為指標(biāo)最佳提取工藝為C2A3B3D1，四因素影響大小順序為C＞A＞B＞D。以上結(jié)果表明，提取因素對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響大小順序一致，僅在因素C（乙醇濃度/%）和D（液料比）水平上有一定差異。

2.2.2 正交試驗方差分析 正交試驗9次實驗總黃酮提取率（%）、葛根素提取率（%）實驗結(jié)果采用 SPSS 19.0軟件處理所得方差分析結(jié)果均見表4～5。

表4 葛根中總黃酮含量測定正交實驗方差分析

表5 葛根中葛根素含量測定正交實驗方差分析

從表4和表5方差分析結(jié)果看，A（超聲溫度）、B（超聲時間）和C（乙醇濃度）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均有顯著性影響，且仍然是乙醇濃度對二者影響最大；D（液料比）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均無顯著性影響；A（超聲溫度）、B（超聲時間）和C（乙醇濃度）三因素對總黃酮提取率（%） 和葛根素提取率 （%） 影響大小順序均為C＞A＞B。這與正交試驗極差分析結(jié)果一致，而與單因素考察實驗結(jié)果極差分析不甚一致。

2.3 驗證試驗 根據(jù)正交實驗結(jié)果對總黃酮提取最佳工藝C1A3B3和葛根素最佳提取工藝為C2A3B3進(jìn)行驗證，結(jié)果見表6。

表6 葛根中總黃酮和葛根素最佳提取工藝驗證實驗結(jié)果表

從表6結(jié)果可看出，總黃酮最佳工藝 C1A3B3和葛根素最佳提取工藝為C2A3B3總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）均遠(yuǎn)高于正交設(shè)計9次實驗最大值，且重現(xiàn)性好，表明提取工藝條件基本穩(wěn)定。然而出現(xiàn)了總黃酮最佳工藝 C1A3B3總黃酮提取率（%）比提取工藝為C2A3B3高0.13%的結(jié)果。

3 討論

3.1 液料比對提取工藝的影響 無論從正交實驗極差分析和方差分析結(jié)果看，D（液料比）對總黃酮提取率（%）和葛根素提取率（%）影響不甚明顯。結(jié)合實際生產(chǎn)，為節(jié)約材料、簡化工藝并利于后續(xù)濃縮干燥操作將 D（液料比） 均可設(shè)定為 5∶1。

3.2 單因素考察極差、正交實驗極差及正交實驗方差對比 正交實驗方差分析結(jié)果與正交試驗極差分析結(jié)果基本一致，而與單因素考察實驗結(jié)果極差分析不甚一致。這可能是因為單因素極差分析只是簡單地將最值進(jìn)行加減，而正交試驗方差和極差分析則是對多組數(shù)據(jù)的影響進(jìn)行綜合評價，通過最佳工藝驗證也可證明正交試驗結(jié)果的可靠性；對多因素多水平僅對單因素考察具有一定的局限性，需要加以正交設(shè)計實驗、均勻設(shè)計實驗以及響應(yīng)面設(shè)計實驗等進(jìn)一步驗證。

3.3 正交試驗極差分析與方差分析 正交試驗極差分析結(jié)果與方差分析基本一致，同時使用方差分析和極差分析對正交實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可使二者相互印證，增加了實驗結(jié)果的可信度。

3.4 正交試驗優(yōu)選工藝與驗證實驗 總黃酮最佳工藝C1A3B3總黃酮提取率（%）比提取工藝為C2A3B3高0.13%，這可能是因為總黃酮對不同水平的乙醇濃度不慎敏感，這從正交試驗不同水平乙醇濃度對總黃酮含量影響結(jié)果，特別是40%和60%這2個濃度的結(jié)果可以看出。

3.5 粉碎粒度對提取工藝的影響 為與葛根提取大生產(chǎn)相適應(yīng)并便于過濾，實驗過程中采用藥材不粉碎而直接考察其提取工藝，實驗結(jié)果與以前樣品處理方法所得結(jié)論有所不同［10］，可能是因為粉碎粒度對葛根總黃酮和葛根素提取率的影響有很大關(guān)系，而且也會影響其他提取參數(shù)對葛根總黃酮和葛根素提取率的影響，這需要進(jìn)一步驗證和考察。