豬瘟抗體檢測試紙研發(fā)及制備工藝的優(yōu)化

孫亞寧，王 麗，王 棟，楊蘇珍，陳鑫鑫，劉亞偉，張立林，鄧瑞廣，張改平,4

(1.河南百奧生物工程有限公司，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，鄭州 450002；3.鄭州大學 材料科學與工程學院，鄭州 450001;4.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，鄭州 450002)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，曾在全球多個國家及地區(qū)廣泛流行，以高熱、全身組織彌散性出血為典型癥狀，急性致死率接近100%[1]，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]，《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020 年)》中將豬瘟列為 5 種優(yōu)先防治的動物疫病之一。通過撲殺與疫苗預防接種相結(jié)合等手段，北美、加拿大、新西蘭等很多國家已成功實現(xiàn)豬瘟凈化，但中國豬瘟仍是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，存在不間斷流行[3]。監(jiān)測豬瘟抗體能準確掌握豬群的免疫抗體水平，對疫苗免疫效果作出評價，因此，建立一種快速簡單的檢測方法在豬瘟防控上意義重大。豬瘟抗體檢測技術(shù)包括病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、正向間接血凝試驗(IHA)等，盡管這些方法具有特異、敏感等優(yōu)點，但不適合在基層廣泛推廣使用。免疫層析技術(shù)是20世紀80年代初期建立的一種基于膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)發(fā)展起來的新型免疫分析技術(shù)，具有方便、快速、準確、無污染、無需儀器設備及專門技術(shù)人員等優(yōu)點[4]，被廣泛應用于醫(yī)學檢測和臨床診斷，已成為目前快速檢測的主要方法之一。同樣，免疫層析技術(shù)也被應用于豬瘟抗體檢測中，豬瘟抗體檢測試紙相繼被報道[5-6]，但在實際檢測中，豬瘟抗體檢測試紙產(chǎn)品的應用并不普遍，究其原因，主要是豬瘟抗體檢測試紙的準確性及穩(wěn)定性備受質(zhì)疑，在基層使用過程中常常出現(xiàn)假信號及試紙失效等問題，嚴重制約該方法的推廣及應用[7]。關(guān)于豬瘟抗體試紙的報道重點在于蛋白的選擇及制備試紙基本條件的建立，而對于保護劑及穩(wěn)定性等問題沒有深入研究[5,8]。豬瘟抗體檢測試紙采用直接法檢測模式：將膠體金標記的豬瘟病毒蛋白噴涂于膠金墊上(玻璃纖維膜)，能與豬瘟抗體結(jié)合的二抗(檢測線)及抗豬瘟病毒蛋白的多抗(質(zhì)控線)噴涂在硝酸纖維素膜上(NC膜)，樣品墊則提供整個反應所必須的緩沖系統(tǒng)。以上這些組分中金標蛋白的緩沖液、膠金墊的處理液、噴膜蛋白的稀釋液及樣品墊的緩沖液，每一個環(huán)節(jié)的處理試劑都具有不同的作用，都決定著成品試紙檢測的準確性、靈敏度及貨架期。本研究對豬瘟抗體檢測試紙中各個環(huán)節(jié)的穩(wěn)定劑進行優(yōu)化，篩選出一套適合于豬瘟抗體檢測試紙的穩(wěn)定劑，并使豬瘟抗體檢測試紙的準確性、靈敏度及穩(wěn)定性滿足商品化需求，為豬瘟抗體檢測試紙能廣泛應用于基層豬瘟抗體檢測奠定基礎，為中國實現(xiàn)豬瘟凈化做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑耗材 Erns-E2 重組蛋白、抗 Erns-E2 重組蛋白單克隆抗體、CSFV 抗體標準陽性血清和CSFV 抗體標準陰性血清均由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備；重組金黃色葡萄球菌 A 蛋白(r-SPA)購于杭州紐龍生物科技有限公司；氯金酸和酪蛋白為美國Sigma公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為美國 Amresco公司產(chǎn)品；Tween 20為美國默克公司產(chǎn)品；PVP-10、PEG20000和Tris為美國 Solarbio 公司產(chǎn)品；Triton X-100為美國 Merck 公司產(chǎn)品；海藻糖為日本 Wako 公司產(chǎn)品。硝酸纖維素膜(HF13502S25,30 cm×2 cm)、玻璃纖維墊和吸水紙為英國 Millipore 公司產(chǎn)品；氫氧化鈉和疊氮鈉等其他試劑為國內(nèi)市售分析純級。

1.1.2 主要儀器 93-3定時恒溫雙向磁力攪拌器購自上海亞榮生化儀器廠；電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；HGS802壓殼機購自杭州峰航科技有限公司；900型薄膜連續(xù)封口機購自廣州華豐包裝設備有限公司；SIGMA4-16K離心機為德國Sigma公司產(chǎn)品；加熱磁力攪拌器為德國IKA公司產(chǎn)品；U-3000 紫外可見分光光度計為日本島津產(chǎn)品；BioDot-XYZ3060三維噴點系統(tǒng)、BioDot-CM 4000斬切機和BioDot-TSR3000讀條儀為美國 Bio-Dot公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

豬瘟抗體檢測試紙由支撐底板、層析膜、金標蛋白墊、樣品墊和吸水墊5部分構(gòu)成(圖1)，樣品墊由玻璃纖維棉經(jīng)樣品墊處理液浸泡干燥后制成；金標蛋白墊由玻璃纖維棉固定金標Erns-E2重組蛋白制成；層析膜為硝酸纖維素膜，其上固定有SPA形成的“檢測線”印跡，固定抗Erns-E2重組蛋白單克隆抗體形成“質(zhì)控線”印跡，用以攔截金標的免疫復合物形成肉眼可見的信號；吸水墊由吸水紙板制成，主要吸收流過層析膜的待檢樣品溶液，為虹吸反應提供動力[9]。

圖1 豬瘟抗體檢測試紙結(jié)構(gòu)Fig.1 Schematic of immunochromatographic test strip for detection of CSFV-specific antibody

1.2.1 膠體金制備及鑒定 參照Frens[10]的研究方法，以檸檬酸三鈉為還原劑制備膠體金。取100 mL超純水于500 mL燒杯中，加入1 mL 10 g/L 氯金酸加熱煮沸，然后在加熱攪拌狀態(tài)下加入1.6 mL 10 g/L檸檬酸三鈉，觀察顏色由無色→藍色→深紅色→亮紅色，直至顏色不再發(fā)生改變時停止加熱，自然冷卻后用超純水定容至100 mL，4 ℃保存。肉眼觀測膠體金狀態(tài)，使用紫外可見分光光度計進行光譜掃描，測定最大吸收波長及吸光值，并用透射電鏡觀察膠體金狀態(tài)，估測粒徑。

1.2.2 膠體金標記Erns-E2重組蛋白 膠體金標記Erns-E2重組蛋白條件優(yōu)化：取純化后的Erns-E2重組蛋白，用微量分光光度計測定蛋白濃度。膠體金分別用0.2 mol/L K2CO32、4、8、12 μL/mL調(diào)節(jié)pH，按照范國英等[11]所述方法測定各pH下最佳蛋白標記量。取每個pH對應的膠體金2管(每管1 mL)，按照2、4、8、12 μL/mL的順序標號為1、2、3、4、5、6、7、8，將對應的最適量蛋白均勻加入膠體金中，充分混勻后室溫靜置反應70 min，1、3、5、7號膠體金標記蛋白用100 μL 100 g/L BSA溶液封閉，2、4、6、8號膠體金標記蛋白用100 μL 50 g/L酪蛋白溶液封閉，反應10 min，12 000 r/min離心25 min，棄上清，沉淀用200 μL金標蛋白保存液重懸，觀察重懸金標蛋白的狀態(tài)，并按照經(jīng)驗選擇測試環(huán)節(jié)以外的其他參數(shù)，如本部分優(yōu)化膠體金標記方法，則按照經(jīng)驗選擇樣品墊、金標墊及噴膜量等參數(shù)組裝試驗用試紙(方法下同)，在試紙的金標墊上點不同標記方法標記的金標蛋白，每條2 μL，分別檢測 1∶200 倍稀釋的標準陰性血清，確定有無非特異性反應，檢測標準陽性血清效價，觀察對試紙靈敏度的影響，從而確定較優(yōu)標記條件。

金標蛋白保存液優(yōu)化：根據(jù)選出的金標蛋白條件標記，取膠體金(每管1 mL，共5管)按選出的標記方法標記、封閉并離心，然后分別用200 μL 1～5號金標蛋白保存液(配方見表1)重懸沉淀，將金標蛋白溶液在室溫環(huán)境下放置1周，觀察金標蛋白狀態(tài)，并組裝試驗用試紙，在試紙的金標墊上點不同重懸液重懸的金標蛋白，每條2 μL，分別檢測1∶200倍稀釋的標準陰性血清，確定有無非特異性反應，檢測標準陽性血清效價，觀察對試紙靈敏度的影響，選擇能保持金標蛋白穩(wěn)定、檢測陰性樣品無非特異性且靈敏度好的為試紙金標蛋白保存液配方。

表1 金標蛋白保存液配方Table 1 Formulationsofcolloidal gold-labeled protein preservation solution

金標蛋白大量制備：取膠體金40 mL加入80 μL 0.2 mol/L K2CO3，在攪拌狀態(tài)下逐滴加入Erns-E2重組蛋白(超純水稀釋為1 mg/mL)480 μL，攪拌均勻后室溫反應70 min，然后在攪拌狀態(tài)下逐滴加入4 mL 50 g/L酪蛋白溶液，攪拌均勻后室溫反應10 min，12 000 r/min離心25 min，棄上清，沉淀用8 mL 4號金標蛋白保存液重懸，4 ℃保存，備用。

金標蛋白墊制備：將金標蛋白按照4、6、8、10 μL/cm的量噴涂在金標墊上，45 ℃干燥1 h，組裝試驗用試紙。檢測1∶200倍稀釋的標準陰性血清，確定有無非特異性反應，檢測標準陽性血清效價評價，試紙靈敏度，選擇靈敏度達到1∶25 600的最少噴涂量為金標蛋白噴涂量，噴涂金標蛋白于膠金墊上，45 ℃干燥1 h，加干燥劑密封保存，備用。

1.2.3 檢測膜制備 檢測線(T線)最佳噴涂條件確定：每份取SPA粉末1 mg，共4份，分別用生理鹽水、PBS、CBS、0.1 mol/L Tris-HCL緩沖液溶解為1 mg/mL的溶液，噴于135NC膜上，42 ℃ 干燥2 h，然后組裝試驗用試紙，檢測標準陽性血清效價，選擇靈敏度較高組對應的緩沖液為檢測線稀釋液。然后稱取SPA粉末1 mg，用選取的檢測線稀釋液分別稀釋成2、1和0.5 mg/mL，噴膜42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗用試紙，檢測標準陽性血清效價，選擇靈敏度達到1∶25 600對應的最低SPA質(zhì)量濃度即為檢測線所噴質(zhì)量濃度。

質(zhì)控線(C線)最佳噴涂條件確定：取抗Erns-E2重組蛋白單克隆抗體，用PBS稀釋為2、1和0.5 mg/mL，以1 μL/cm的量噴于135NC膜上為C線，同時噴涂T線(最佳參數(shù))，42 ℃干燥2 h，然后組裝試驗用試紙，檢測標準陽性血清效價，選擇C線清晰，且不隨檢測樣品濃度改變而改變的最低質(zhì)量濃度為質(zhì)控線噴涂量。

1.2.4 樣品墊制備 取玻璃纖維棉切割成1.8 cm×30 cm大小，分別浸泡于表2的不同配方中5 min，然后于42 ℃干燥4 h，分別與制備好的試紙各組份組裝成試紙，檢測試紙靈敏度，確定較優(yōu)配方。

表2 樣品墊緩沖液配方Table 2 Formulation of buffer systems for sample pad

1.2.5 試紙組裝與切割 分別將檢測膜、金標墊、樣品墊和吸水墊按圖1所示依次粘貼于支撐板上，且各組份連接處應有2 mm重疊，然后使用切割機切割成2.8 mm×60 mm的試紙，顯色區(qū)應平整無壓痕，然后裝殼，裝袋，加干燥劑密封。

1.2.6 試紙穩(wěn)定性檢測 包裝好的豬瘟抗體檢測試紙于45 ℃保存，進行加速穩(wěn)定試驗，45 ℃下保存37.5 d相當于25 ℃下保存1 a，30 ℃下保存6個月[9]。分別在4、8、12、16、20周取樣檢測試紙靈敏度，從而確定試紙保質(zhì)期。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金質(zhì)量鑒定

肉眼觀測制備的膠體金呈酒紅色，顏色透亮、無沉淀及漂浮物；紫外可見分光光度計掃描最大吸收峰為526 nm；透射電鏡下形狀較規(guī)則，隨機測量20個顆粒，平均粒徑為26 nm左右(圖2)，適合免疫層析檢測。

2.2 膠體金標記Erns-E2重組蛋白條件確定

由表3可知，4號金標蛋白透亮無沉淀，檢測陰性樣品無非特異性反應，檢測陽性樣品效價可達1∶25 600，所以最終確定最佳條件為：1 mL膠體金中加入0.2 mol/L K2CO34 μL調(diào)節(jié)pH，然后加入12 μg的Erns-E2重組蛋白，室溫攪拌反應70 min，加50 g/L酪蛋白溶液100 μL，室溫封閉10 min，12 000 r/min離心25 min，棄上清，沉淀用金標蛋白保存液重懸。

圖2 膠體金電鏡掃描結(jié)果Fig.2 Thecolloidal gold particles scanned by electron microscope

2.3 金標蛋白保存液

從圖3可以看出，1、2和3號重懸金標蛋白穩(wěn)定性差，已經(jīng)板結(jié)無法用于檢測，4和5號重懸金標蛋白狀態(tài)穩(wěn)定，酒紅色透亮無沉淀，可用于檢測；每條點金2 μL，檢測1∶200倍稀釋的標準陰性血清及標準陽性血清效價(表4)。

表3 Erns-E2重組蛋白膠體金標記條件的優(yōu)化Table 3 Optimization of colloidal gold labeling conditions of Erns-E2 recombinant

結(jié)果顯示5號保存液重懸的金標蛋白穩(wěn)定性和檢測靈敏度優(yōu)于1～4號，且無非特異性反應，所以確定金標蛋白保存液配方：Na2B4O7·10H2O 30.5 g/L，BSA 10 g/L，蔗糖50 g/L，Triton X-100 5 g/L，NaN30.3 g/L，溶液為超純水。

2.4 金標蛋白墊制備

由表5可知，金標蛋白噴涂量為6 μL/cm時試紙已經(jīng)達到所需檢測靈敏度，因此將金標蛋白以6 μL/cm的量噴涂在玻璃纖維棉上，45 ℃干燥1 h制備金標墊。

圖3 金標蛋白保存液穩(wěn)定性Fig.3 Stability of colloidal gold-labeled protein in different preservation solutions

保存液Preservation solutions金標蛋白狀態(tài)Gold-labeled protein status陰性樣品Negative sample靈敏度Sensitive1深紫色,板結(jié) Purple,hardening//2深紫色,板結(jié) Purple,hardening//3深紫色,板結(jié) Purple,hardening//4酒紅色,透亮,無沉淀 Wine,clear,no precipitate-1∶6 4005酒紅色,透亮,無沉淀 Wine,clear,no precipitate-1∶12 800

注：“/”表示未檢測；“-”表示陰性結(jié)果。下同。

Note:“/” undetected;“-” negative results.The same below.

表5 金標蛋白噴涂量的選擇結(jié)果Table 5 Optimization of quantity of colloidal gold-labeled protein in conjugate pads

2.5 檢測膜的制備

2.5.1 檢測線(T線)的制備 檢測線蛋白緩沖液檢測結(jié)果與生理鹽水、PBS、CBS為緩沖液時檢測結(jié)果相似，試紙靈敏度均達到1∶12 800，使用0.1 mol/L Tris-HCL為緩沖液時顯色較好，試紙靈敏度可達1∶25 600。因此選擇使用0.1 mol/L Tris-HCL緩沖液稀釋SPA并優(yōu)化噴膜質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，當噴膜質(zhì)量濃度為1 mg/mL時試紙檢測標準陽性血清效價已達1∶25 600，因此檢測線處理用0.1 mol/L Tris-HCL配置的1 mg/mL 的SPA溶液，以1 μL/cm的量噴涂135NC膜，42 ℃干燥2 h。

2.5.2 質(zhì)控線(C 線)的制備 取抗Erns-E2重組蛋白單克隆抗體，用PBS稀釋為 2、1和 0.5 mg/mL，以 1 μL/cm 的量噴涂于 135NC 膜上為 C 線、同時噴涂 T 線(最佳參數(shù))，42 ℃干燥 2 h，然后組裝試紙，檢測標準陽性血清效價，結(jié)果顯示，當單抗質(zhì)量濃度達1 mg/mL 時 C 線清晰，且不隨檢測樣品質(zhì)量濃度改變而變化，因此選擇抗 Erns-E2 重組蛋白單克隆抗體質(zhì)量濃度為 1 mg/mL 噴涂質(zhì)控線。

2.6 樣品墊的制備

樣品墊主要提供檢測反應所需環(huán)境，合適的樣品墊可以避免假信號、增加檢測靈敏度及穩(wěn)定性，對試紙靈敏度及穩(wěn)定性影響很大，根據(jù) 6 種配方制備的樣品墊制備試紙檢測 CSFV 抗體標準陽性血清，結(jié)果顯示配方 5 試紙檢測靈敏度最好，效價可達1∶25 600，因此確定 CSFV 試紙樣品墊處理液配方為：酪蛋白 10 g/L，Triton X-100 5 g/L，NaN30.3 g/L，溶液為 0.1 mol/L PBS。

2.7 試紙穩(wěn)定性

將包裝好的豬瘟抗體檢測試紙于 45 ℃保存，進行加速穩(wěn)定試驗，結(jié)果見表 6，試紙在 45 ℃保存16 周時試紙靈敏度出現(xiàn)明顯的下降，因此試紙可以在 45 ℃條件下穩(wěn)定保存 12 周，相當于 25 ℃保存 2 a，30 ℃下保存 14個月，考慮溫度的變化和可能遇到的惡劣環(huán)境，因此產(chǎn)品保質(zhì)期確定為 1 a。

表6 豬瘟抗體檢測試紙穩(wěn)定性Table 6 Stability of CSFV-specific antibody detection strip

3 討 論

制備高質(zhì)量的豬瘟抗體檢測試紙具有很多關(guān)鍵點，雖然基礎是有好的抗原及抗體，但在制備試紙的過程中，每一個環(huán)節(jié)都將影響試紙最后的靈敏度、準確性及穩(wěn)定性[12]。針對豬瘟抗體檢測試紙，本研究在膠體金標記時進行 pH、封閉蛋白及保存液的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)膠體金標記抗原時應選擇中性稍偏堿的緩沖液可以大大提高標記效率，標記后選用酪蛋白封閉，可以降低試紙的非特異性；金標蛋白保存液在堿性離子環(huán)境及較高糖濃度時，更有利于金標抗體穩(wěn)定，選用 BSA 為蛋白保護劑比酪蛋白更有利于抗原抗體反應，提高試紙靈敏度。在樣品墊制備中分別優(yōu)化保護蛋白、表面活性劑及緩沖液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性的 PBS 緩沖液、Triton X-100及 BSA 更有利于抗原抗體反應，制備的試紙靈敏度更好，表面活性劑 Tween-20 加入樣品墊會降低樣品墊的黏附性，不利于樣品墊在底板上的固定，同時會增加試紙的假陽性反應。

4 結(jié) 論

本研究對豬瘟抗體檢測試紙制備的各環(huán)節(jié)，特別是產(chǎn)品緩沖系統(tǒng)中的穩(wěn)定劑進行優(yōu)化，確定豬瘟抗體檢測試紙產(chǎn)品化的具體參數(shù)，為豬瘟抗體檢測試紙的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎。豬瘟抗體檢測試紙的較優(yōu)參數(shù)如下：膠體金平均粒徑為 26 nm；膠體金標記 Erns-E2 重組蛋白時最佳 pH為中性稍偏堿，此時的蛋白標記效率較高，且穩(wěn)定性好；蛋白最佳標記條件為 1 mL 膠體金加入 12 μg 的 Erns-E2 重組蛋白，金標蛋白選用酪蛋白封閉可以有效減低試紙的非特異性，金標蛋白保存液選用 Na2B4O7·10H2O提供堿性環(huán)境，加入 BSA 10 g/L、蔗糖50 g/L、Triton X-100 5 g/L和 NaN30.3 g/L能更有效地保護金標蛋白的活性及穩(wěn)定性；因為檢測對象為生理鹽水稀釋的血清，因此樣品墊處理時較為簡單的 pH 中性配方為 0.1 mol/L PBS溶液含酪蛋白 10 g/L、Triton X-100 5 g/L、NaN30.3 g/L，可以獲得較好的檢測靈敏度和準確性。