參一膠囊聯(lián)合5-氟尿嘧啶對小鼠結(jié)腸癌血管生成抑制作用的機制研究

尤江蓮，郭 治，孫愛學(xué)

(河北省邢臺市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，河北 邢臺 054000)

結(jié)腸癌最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活習(xí)慣、食物譜發(fā)生了巨大變化，結(jié)腸癌的發(fā)生率也呈明顯的上升趨勢[1]。局部復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的主要原因，血管生成是腫瘤組織保持高指數(shù)生長的營養(yǎng)前提，也是許多靶向藥物作用的靶點[2-3]。結(jié)腸癌的化療研究已達(dá)到了瓶頸期[4]，如何進(jìn)一步提高化療療效，充分發(fā)掘祖國醫(yī)藥在結(jié)腸癌中的應(yīng)用價值是一項嚴(yán)峻的課題。參一膠囊主要由人參皂苷Rg3成分組成，多項研究證實，其與傳統(tǒng)化療藥物配合，可增強對實體瘤的抑制作用[5-6]。但目前，關(guān)于參一膠囊在結(jié)腸癌中的研究報道極少。因此，本研究建立了BALB/c小鼠LoVo結(jié)腸癌模型，旨在探討參一膠囊對結(jié)腸癌生長及血管生成的抑制作用及可能的機制，以期為日后的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

50只SPF級BALB/c雄性小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量約23～27 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0001]。實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心進(jìn)行[SYXK (冀) 2013-0056]，溫度21℃～25℃，自由飲食飲水，并按實驗動物使用的3R原則給與人道主義關(guān)懷。河北醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，審查編號：20170816。

1.1.2 細(xì)胞株

LoVo(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)購于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器

VEGFA多克隆抗體、Gli1多克隆抗體購于美國Abcam公司。5-氟尿嘧啶注射液(5-FU)購于天津金耀氨基酸有限公司(批號0404281)，參一膠囊購于吉林亞泰制藥股份有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字Z20030044)。Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于天能科技有限公司(Tanon4200SF)，微量移液器購于美國BD公司；-80℃超低溫冰箱(美國 Thermo 公司)；-20℃冰箱和4℃冰箱(中國海爾公司)。

1.3 結(jié)腸癌小鼠模型構(gòu)建及分組

1.3.1 結(jié)腸癌小鼠模型的制備

采用細(xì)胞懸液接種液，收集對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞，稀釋濃度為1×107個/mL，在小鼠前肢腋下皮下接種2×107個細(xì)胞。注射后按壓數(shù)秒，5天后建模成功者作為實驗小鼠。(2)分組標(biāo)準(zhǔn)：造模成功后，將50只小鼠隨機分為5組，根據(jù)處理方式的不同分別定義為為：①模型組：僅予以0.3 mL生理鹽水灌胃。②5-FU組：采用腹腔注射5-FU，劑量為30 mg/kg。③參一膠囊低劑量組：灌服參一膠囊2 g/kg。④參一膠囊高劑量組：灌服參一膠囊4 g/kg。⑤參一膠囊+5-FU組：腹腔注射5-FU(30 mg/kg)+灌服參一膠囊4 g/kg。以上治療措施均為每日一次，共用25 d。

1.3.2 觀察指標(biāo)

(1)腫瘤體積：根據(jù)公式：V=0.5×腫瘤長徑×(與長徑垂直的短徑)2，根據(jù)測量結(jié)果繪制腫瘤體積變化的折線圖。(2)腫瘤微血管密度(MVD)：在第25天時處死小鼠，取腫瘤組織切片脫蠟，胰酶消化，PBS及H2O2沖洗，牛血清蛋白封閉，滴加CD34單抗，PBS沖洗后滴加羊抗兔IgG，蘇木素染色，脫水，二甲苯透明。在低倍鏡下選擇一個微血管最多的區(qū)域，再調(diào)整至200倍視野計算微血管均數(shù)。(3)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移情況：處死小鼠后，取淋巴結(jié)、腹膜、肝、肺等部位的組織標(biāo)本，甲醛固定，HE染色，行病理學(xué)檢查。

1.3.3 Western blot檢測Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)

液氮研磨各組小鼠瘤組織，裂解，提取總蛋白，BCA發(fā)測定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL法顯影定影。通過Quantity One軟件分析條帶強度，以β-actin為內(nèi)參，檢測Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同組小鼠腫瘤體積及抑瘤率比較

從干預(yù)開始，每5 d測量一次腫瘤體積，計算抑瘤率。與模型組相比，各治療組小鼠的腫瘤體積均受到明顯抑制。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+ 5-Fu組的抑瘤率最高，且隨著給藥時間的延長，這種抑制優(yōu)勢愈加明顯。見圖1。

2.2 不同組小鼠免疫器官情況比較

與模型組比較，5-FU組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)出現(xiàn)降低，其余治療組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)均有不同程度提高。5-FU組與參一膠囊低劑量組的各指標(biāo)差異均無顯著性(P>0.05)，參一膠囊高劑量組的胸腺質(zhì)量、脾質(zhì)量明顯高于5-FU組及參一膠囊低劑量組，參一膠囊+ 5-FU組的胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾質(zhì)量、脾指數(shù)改善最為顯著，明顯好于所有其他治療組(P<0.05)。見表1。

注：A：模型組；B：5-FU組；C：參一膠囊低劑量組；D：參一膠囊高劑量組；E：參一膠囊+ 5-FU組。圖1 不同組小鼠腫瘤體積變化曲線Note: A: Model group; B: 5-FU group; C: Shenyi capsule low dose group; D: Shenyi capsule high dose group; E: Shenyi capsule + 5-FU group.Figure 1 Changes of tumor volume of mice in different groups

2.3 不同組小鼠MVD比較

模型組、5-FU組、參一膠囊低劑量組、參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組小鼠腫瘤的MVD分別為(13.67±4.61)、(11.67±4.12)、(5.34±2.24)、(2.32±1.57)、(0.67±0.51)，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，參一膠囊+5-FU組對MVD的抑制作用最明顯，參一膠囊高劑量組次之，低劑量組抑制更弱，單純5-FU組對腫瘤MVD無明顯影響。見圖2。

表1 不同組小鼠免疫器官情況比較Table 1 Comparison of immune organs of mice in different groups

注：與模型組相比，aP< 0.05；與5-FU組相比，bP< 0.05；與參一膠囊低劑量組相比，cP< 0.05；與參一膠囊高劑量組相比，dP< 0.05。
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05. Compared with the Shenyi capsule low dose group,cP< 0.05. Compared with the Shenyi capsule high dose group,dP< 0.05.

2.4 不同組小鼠結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移情況比較

模型組小鼠的局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、肝轉(zhuǎn)移率、肺轉(zhuǎn)移率、腹膜轉(zhuǎn)移率分別為100%(10/10)、80%(8/10)、70%(7/10)、90%(9/10)。與模型組相比，5-FU組、參一膠囊低劑量組小鼠各種類型的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P>0.05)。高劑量參一膠囊組、參一膠囊+5-FU組小鼠的結(jié)腸癌各器官轉(zhuǎn)移率均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5 不同組小鼠腫瘤組織Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，5-FU組及參一膠囊低劑量組小鼠的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量均較低，但差異無顯著性(P>0.05)。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量則顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。見表3。

注：兩組之間比較，※P< 0.05。圖2 不同組小鼠MVD比較Note. Comparisons between the two groups,※P < 0.05.Figure 2 Comparison of MVD of mice in different groups

表2 不同組小鼠結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移情況比較Table 2 Comparison of colon cancer metastasis in mice of different groups

注：與模型組相比，aP< 0.05；與5-FU組相比，bP< 0.05。
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05.

表3 不同組小鼠腫瘤組織Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量比較Table 3 Comparison of Gli1 and VEGF protein expressions in tumor tissues of mice in different groups

注：與模型組相比，aP<0.05；與5-FU組相比，bP<0.05
Note. Compared with the model group,aP< 0.05. Compared with the 5-FU group,bP< 0.05.

3 討論

傳統(tǒng)中藥人參具有大補元氣、補脾益肺、安神益智的功效，人參皂苷是其主要成分。參一膠囊是從人參中提取的有效單體，代號為Rg3，是傳統(tǒng)中藥人參中一種微量的四環(huán)三萜皂苷。有研究表明，其與化療合并用藥，對小鼠肝癌模型有顯著的增強化療療效作用，并可調(diào)節(jié)免疫功能，預(yù)防白細(xì)胞下降。在人體中，主要作用表現(xiàn)為，培元固本，補益氣血，改善腫瘤患者的氣虛癥狀，提高機體免疫功能。以往的研究表明，人參皂苷Rg3可通過作用于細(xì)胞增殖周期G2/M期，抑制腫瘤生長，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時，具有抑制新生血管形成以及調(diào)節(jié)機體免疫功能等作用。參一膠囊多種實體腫瘤的生長具有抑制作用，是化療增效劑，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等[7-8]。尤其是對于晚期非小細(xì)胞肺癌，參一膠囊可通過抑制腫瘤血管生成，提高患者免疫功能，起到顯著的化療增效減毒效應(yīng)[9-10]。但在結(jié)腸癌中，相關(guān)的研究報道很少。

以VEGF為靶點的多種抗腫瘤藥物已被應(yīng)用于臨床，但在臨床實踐中，普遍未獲得與動物實驗相似的理想效果，有效率最低僅在30%左右[11]。同時，對多線治療失敗的轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌，持續(xù)應(yīng)用VEGF抑制劑的有效性仍需要更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本研究在建立BALB/c小鼠LoVo結(jié)腸癌模型的基礎(chǔ)上，對5組小鼠采取不同的處理方式，包括生理鹽水灌胃、腹腔注射5-FU、灌服參一膠囊2 g/kg、灌服參一膠囊4 g/kg以及腹腔注射5-FU(30 mg/kg)+灌服參一膠囊4 g/kg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，各治療組小鼠的腫瘤體積均受到明顯抑制。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-Fu組的抑瘤率最高，且隨著給藥時間的延長，這種抑制優(yōu)勢愈加明顯。這表明，參一膠囊聯(lián)合5-Fu可產(chǎn)生更明顯的協(xié)同作用。胸腺與脾是小鼠最重要的免疫器官，其中，胸腺與細(xì)胞免疫相關(guān)，與自身免疫耐受及自穩(wěn)功能維持密切相關(guān)。脾是外周淋巴器官，是免疫活性細(xì)胞分化成熟的場所，也是免疫應(yīng)答的場所。二者對細(xì)胞毒性物質(zhì)十分敏感，在化療藥物的作用下可迅速發(fā)生結(jié)構(gòu)損傷及功能障礙，因此，胸腺與脾的質(zhì)量在一定程度上可作為評價藥物對免疫系統(tǒng)功能影響的指標(biāo)[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各治療組小鼠的免疫器官質(zhì)量及指數(shù)均有不同程度提高，但5-FU組與參一膠囊低劑量組的各指標(biāo)改善情況均無明顯差異，而參一膠囊+5-FU組的胸腺質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾質(zhì)量、脾指數(shù)改善顯著，明顯好于所有其他治療組，這反應(yīng)了參一膠囊對免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。

Hedgehog信號通路由1個配體、2個跨膜蛋白、3個下游轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)構(gòu)成，整個信號通路最終通過Gli控制靶基因的表達(dá)而產(chǎn)生作用[13; 14]。在本研究中，我們通過敏感度較高的Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，5-FU組及參一膠囊低劑量組小鼠的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量均較低，但差異無顯著性(P>0.05)。參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組的Gli1蛋白、VEGF蛋白表達(dá)量則顯著降低，差異有顯著性。這表明，Hedgeog-Glin1信號通路相關(guān)的VEGF表達(dá)可能是參一膠囊作用的靶點之一。Smo蛋白是Hedgehog信號通路的跨膜蛋白之一，Yzmazaki等[15]發(fā)現(xiàn)，與Smo-的結(jié)腸癌組織相比，Smo+結(jié)腸癌組織的微血管密度明顯更高，這提示Hedgeog-Glin1信號通路可能參與了腫瘤微血管的生成。在本研究中，模型組、5-FU組、參一膠囊低劑量組、參一膠囊高劑量組、參一膠囊+5-FU組小鼠腫瘤的MVD分別為(13.67±4.61)、(11.67±4.12)、(5.34±2.24)、(2.32±1.57)、(0.67±0.51)，參一膠囊+5-FU組對MVD的抑制作用最明顯，參一膠囊高劑量組次之，低劑量組抑制更弱，單純5-FU組對腫瘤MVD無明顯影響。同時，參一膠囊+5-FU組的VEGF蛋白表達(dá)量也顯著降低。這表明，集解毒、扶正、活血等功效于一方的參一膠囊對結(jié)腸癌動物模型有良好的治療效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，參一膠囊對結(jié)腸癌腫細(xì)胞長及血管生成均有明顯的抑制作用，這種抑制作用在于5-FU配伍應(yīng)用時更為顯著，Hedgeog-Glin1信號通路相關(guān)的VEGF表達(dá)可能是其主要的作用靶點。