阿司匹林對(duì)控制大鼠鹽敏感性高血壓的作用機(jī)制研究

劉 雪，楊宇輝，付 慧，劉 星，姜曉亮，楊志偉*

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2. 北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021；3. 首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069)

原發(fā)性高血壓是一種慢性復(fù)雜疾病，我國目前高血壓患者已有2億多人，其中鹽敏感性高血壓患者約占總患者的60%[1]，這些鹽敏感性患者往往伴有動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等嚴(yán)重的靶器官損傷[1-3]。有研究表明，高鹽能夠刺激血管內(nèi)皮產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)而誘發(fā)血管炎癥[4-5]。血小板活化能夠通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與內(nèi)皮功能損傷、血管硬化和血管炎癥等血管病變，促進(jìn)鹽敏感性高血壓以及多種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6-10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，鹽敏感性高血壓患者體內(nèi)血小板活性增強(qiáng)[11]。阿司匹林作為一種抗血小板藥物，近年來在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。2016年，美國已經(jīng)將阿司匹林作為心血管疾病的一級(jí)預(yù)防用藥[12]，這再次引起了國內(nèi)外對(duì)阿司匹林的關(guān)注。阿司匹林是否能抑制鹽敏性高血壓的發(fā)生發(fā)展，在國內(nèi)外還沒見報(bào)道。本研究旨在探討阿司匹林是否能夠抑制高鹽誘導(dǎo)的高血壓的發(fā)生發(fā)展及其相關(guān)機(jī)制，為高血壓及其靶器官損傷的防治探索新的依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性血壓鹽敏感性Dahl SS大鼠及其對(duì)照血壓鹽耐受性SS-13BN大鼠從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買[SCXK (京) 2016-0006]。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房開展[SYXK (京) 2015-0035]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)[ILAS-YZW2016004]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，光照、溫度、濕度設(shè)置嚴(yán)格參照我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則，給予人道主義關(guān)懷。將2月齡Dahl SS大鼠(平均體重190±10 g)以及SS-13BN大鼠(平均體重 185.1±9 g)，各自隨機(jī)分為三組，即低鹽組(0.12% NaCl，8只)、高鹽組(8% NaCl, 10只)、高鹽加阿司匹林灌胃組(8% NaCl+10 mg/(kg·d), 10只)，6組大鼠體重差異無顯著性(P>0.05)，喂養(yǎng)至8周，期間在清醒狀態(tài)下用尾袖法連續(xù)測(cè)量大鼠血壓。8周后采用頸總動(dòng)脈插管測(cè)量血壓，2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取大鼠皮膚、腎、動(dòng)脈血管，分別檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量、相關(guān)炎癥因子和血管蛋白的表達(dá)。

1.2 主要試劑與儀器

阿司匹林(7293748372)和羧甲基纖維素(S14015-250 g)購自美國Sigma公司；Anti-Mannore Receptor (ab64693)、Anti-Von Willebrand Factor antibody (ab6994) 購自英國Abcom公司； eNOS(#32027)、IL-6單克隆抗體 (#12912) 購自美國Cell Signaling Technology公司；Goat anti rabbit IgG-HRP (sc-2004)、 TNF-α單克隆抗體 (sc-52746)、L-1β多克隆抗體購自美國Santa Cruz (sc-7884) 公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(P0010)購自中國碧云天公司；Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；DEPC 水購自美國 QIAGEN 公司；BP2000無創(chuàng)血壓檢測(cè)儀購自美國Visitech Systems公司；PCR 儀購自美國 Bio-Rad 公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Tanon-5500)購自上海天能公司；Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司； ABI stepone 熒光定量 PCR 儀購自美國Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Real-time PCR檢測(cè)腎組織炎癥因子表達(dá)

取少量腎組織(100～200 mg)放于5 mL EP管中，加入1 mL的TRIzol，放入攪拌器中充分研磨。加入200 μL 氯仿，用帶濾芯的槍頭移至干凈的1.5 mL EP管中混勻。冰上靜止5 min，4℃，16 000 r/min，離心30 min，取上清。加入500 μL異丙醇混勻后，室溫靜置10 min，11 235 r/min離心10 min棄上清。加入500 μL DEPC水稀釋的75%的乙醇，4℃，12 000 r/min，離心5 min，棄上清。超凈臺(tái)晾干，加入適量的DEPC水稀釋得RNA。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用One-stop PCR儀檢測(cè)其IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)。

1.3.2 免疫熒光檢測(cè)皮膚巨噬細(xì)胞浸潤

大鼠皮膚用福爾馬林固定后，修塊、脫水、包埋、切片(厚度為4 μm)，用Xylene、逐步降低的Ethanol濃度(分別100%、95%、75%)和PBS使組織切片脫蠟、再水化。皮膚組織用0.1% Triton X-100、10 mM sodium citrate (pH 6.0)、3% H2O2,處理，然后用含10% 血清的PBS在4℃過夜孵育。用MR(1∶100稀釋)在室溫孵育1 h后用Vector VIP substrate kit (Vector)試劑盒，逐步進(jìn)行二抗孵育、DAPI封片后，最后顯微鏡下觀察、拍片。

1.3.3 免疫印跡檢測(cè)血管蛋白表達(dá)

提取大鼠胸主和腹主動(dòng)脈血管全蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液(0.1%緩血酸銨緩沖液配制5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h，加抗eNOS和vWF特異性抗體4℃孵育過夜，0.1%緩血酸銨緩沖液洗膜3次后加辣根過氧化物標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，洗膜3次后，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀自動(dòng)曝光顯影后使用Image J軟件分析灰度，結(jié)果以目的蛋白/β-actin灰度值比值表示蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林可顯著降低高鹽誘導(dǎo)的Dahl SS大鼠的血壓

大鼠動(dòng)脈血壓連續(xù)測(cè)量結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)開始前三周，正常鹽組、高鹽組、高鹽同時(shí)給與阿司匹林灌胃組的Dahl大鼠血壓無明顯差異，從第四周開始，高鹽組大鼠血壓較正常鹽組大鼠血壓呈現(xiàn)大幅增長的現(xiàn)象，高鹽加阿司匹林灌胃組大鼠較高鹽組大鼠血壓有明顯較低的趨勢(shì)(表1)。八周之后采用頸總動(dòng)脈插管測(cè)量血壓，結(jié)果顯示與正常組相比高鹽喂養(yǎng)導(dǎo)致Dahl SS大鼠平均動(dòng)脈壓血壓由(146±7.3)mmHg升高至(201±11.2) mmHg(P<0.05)，給予阿司匹林灌胃之后發(fā)現(xiàn)大鼠血壓由(201±11.2)mmHg降低至(169±5.6)mmHg(P<0.05)。而高鹽和阿司匹林對(duì)SS-13BN大鼠的血壓并無影響(圖1，表2)。這表明阿司匹林能夠降低Dahl SS大鼠有由高鹽誘導(dǎo)的血壓增高。

2.2 阿司匹林減少了腎組織炎癥因子的表達(dá)

炎癥反應(yīng)是高血壓發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要病理機(jī)制。因此，我們檢測(cè)了腎組織中的炎癥因子。結(jié)果顯示Dahl SS大鼠高鹽喂養(yǎng)之后，隨著血壓的升高，其腎組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)增加，阿司匹林能夠抑制Dahl SS大鼠腎組織高鹽誘導(dǎo)的炎癥因子的增加(見圖2)。

2.3 阿司匹林增加皮膚中M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量

為了進(jìn)一步探討阿司匹林是否能抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，我們檢測(cè)了Dahl SS大鼠皮膚中M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量，結(jié)果表明，給予高鹽處理之后Dahl大鼠皮膚中的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量較正常鹽組相比顯著減少，而給予阿司匹林灌胃干預(yù)之后，Dahl大鼠皮膚巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量顯著增加，這表明阿司匹林能夠有效緩解高鹽誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少(見圖3)。

表1 鹽敏感性高血壓大鼠血壓情況Table 1 Blood pressure of Dahl salt sensitive rats

注：尾袖法連續(xù)八周檢測(cè)清醒狀態(tài)下鹽敏性高血壓大鼠動(dòng)脈血壓，即收縮壓以及舒張壓。
Note. The arterial blood pressure including systolic pressure and diastolic pressure of Dahl salt-sensitive rats (DSS) was measured by the tail cuff method in an awake state.

表2 鹽耐受性高血壓大鼠血壓情況Table 2 Blood pressure of salt resistance rats

注：尾袖法連續(xù)八周檢測(cè)鹽耐受性大鼠清醒狀態(tài)下動(dòng)脈血壓,包括收縮壓以及舒張壓.
Note. The arterial blood pressure including systolic pressure and diastolic pressure of Dahl salt-sensitive rats (13-BN) was measured by the tail cuff method in an awake state.

注：LS：低鹽飲食組，0.12% NaCl；HS：高鹽飲食組，8% NaCl；HS + ASA：高鹽飲食(8% NaCl)加阿司匹林灌胃組(10 mg/(kg·d))。下圖同。第56天采用頸總動(dòng)脈插管測(cè)量大鼠動(dòng)脈血壓。與LS組、HS + ASA組相比，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖1 阿司匹林對(duì)高鹽誘導(dǎo)的Dahl SS大鼠高血壓的影響Note: LS: low-salt diet, 0.12% NaCl; HS: high-salt diet, 8% NaCl; HS + ASA: high-salt diet (8% NaCl) plus aspirin gavage (10 mg/(kg·d)). The same in the following figures. Blood pressure was measured by the tail cuff method at day 56. Compared with LS group, HS + ASA group,*P< 0. 05 (one-way ANOVA).Figure 1 The effect of aspirin on blood pressure in Dahl SS rats with a high-salt diet

注： IL-1β：白介素-1β； IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α。第56天取材RT-PCR檢測(cè)炎癥因子。與LS組、HS + ASA組相比，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖2 阿司匹林對(duì)高鹽誘導(dǎo)的Dahl SS大鼠腎組織炎癥因子表達(dá)的影響Note. IL-1β: interleukin-1β; IL-6: interleukin-6; TNF-α: tumor necrosis factor-α. Inflammatory factors were measured at day 56 by RT-PCR. Compared with the LS group, HS + ASA group,*P< 0. 05 (one-way ANOVA).Figure 2 The effect of aspirin on the mRNA expressions of renal inflammatory factors in Dahl SS rats with a high-salt diet

注：MR：M2型巨噬細(xì)胞表面特定的標(biāo)志分子甘露糖受體。圖3 阿司匹林對(duì)高鹽誘導(dǎo)的Dahl SS大鼠皮膚M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響(× 200)Note. MR: mannose receptor, a specific maker of M2 macrophages.Figure 3 The effect of aspirin on the number of M2 macrophages in the skin of Dahl SS rats with a high-salt diet

2.4 阿司匹林能夠改善血管內(nèi)皮功能

為了探討阿司匹林是否能通過改善血管功能降低血壓，我們檢測(cè)了Dahl-SS大鼠血管內(nèi)皮表達(dá)的血管舒張促進(jìn)蛋白一氧化氮合酶(eNOS)和血管損傷標(biāo)志物血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的表達(dá)。結(jié)果顯示，較低鹽組相比，高鹽喂養(yǎng)的Dahl大鼠血管一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)顯著降低，血管性血友病因子(vWF)表達(dá)顯著增高(P<0.05)，表明阿司匹林能夠抑制高鹽誘導(dǎo)的Dahl-SS大鼠血管內(nèi)皮eNOS表達(dá)的降低(見圖4A)和vWF表達(dá)的增加(見圖4B)。

注：eNOS：內(nèi)皮一氧化氮合酶；vWF：血管性血友病因子。與LS組、HS + ASA組比較，*P< 0.05(one-way ANOVA)。圖4 阿司匹林對(duì)高鹽誘導(dǎo)的Dahl SS大鼠血管內(nèi)皮功能的影響Note. eNOS: endothelial nitric oxide synthase; vWF: von Willebrand factor. Compared with LS group, HS + ASA group,*P < 0.05 (one-way ANOVA).Figure 4 The effect of aspirin on vascular endothelium function in Dahl SS rats with a high-salt diet

3 討論

鹽敏感性高血壓是指相對(duì)高鹽攝入引起的血壓增高，其發(fā)病機(jī)理包括血管的收縮、機(jī)體的鈉水潴留、血管炎癥反應(yīng)等[13]。巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的主要作用細(xì)胞，在不同條件下，有著明顯的形態(tài)和功能差異。M1型巨噬細(xì)胞一般是通過干擾素-γ及細(xì)菌脂多糖LPS活化，M1主要分泌促炎因子；而M2型巨噬細(xì)胞通過Th2細(xì)胞因子進(jìn)行活化，M2表達(dá)抑制炎癥因子，起著抑制炎癥反應(yīng)以及組織修復(fù)的作用。高鹽引起高血壓的同時(shí)，也可誘導(dǎo)腦血管、心臟和腎等靶器官的損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食誘導(dǎo)Dahl SS大鼠血壓升高的同時(shí)，增加了腎組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及血管vWF因子的表達(dá)，減少了皮膚M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量及血管eNOS的表達(dá)；阿司匹林能夠明顯降低Dahl SS大鼠高鹽誘導(dǎo)的血壓升高、炎癥反應(yīng)及血管功能的損傷。我們的研究表明阿司匹林能夠通過抑制血小板活性，抑制血管的炎癥反應(yīng)，從而抑制高鹽誘導(dǎo)的高血壓的發(fā)生發(fā)展及其血管功能的損傷。

血小板是由骨髓造血組織中的巨核細(xì)胞產(chǎn)生的一種無核的細(xì)胞成分，越來越多的研究表明血小板在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[14]，阿司匹林是最廣泛使用的抗血小板藥物，不可逆地抑制血小板內(nèi)COX-1和COX-2的活性，阻斷花生四烯酸產(chǎn)生TXA2，抑制血小板的聚集[15]。臨床常用抗血小板藥物阿司匹林預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈疾病和其他血管疾病，主要是由于阿司匹林可抑制血小板COX-1活性，降低血小板活化率，減少血清P-selectin、TXA2的表達(dá)及炎癥因子IL-6等的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，參與穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈疾病的治療[16-18]。阿司匹林能夠抑制氧化應(yīng)激，降低原發(fā)性高血壓和血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽能夠刺激血管內(nèi)皮并激活血小板從而引發(fā)血管炎癥反應(yīng)，而阿司匹林可以抑制該過程的發(fā)生發(fā)展，表明阿司匹林在抑制血小板聚集的同時(shí)，也具有抑制血小板活性的功能。該結(jié)果證實(shí)阿司匹林通過抑制血小板活性，能夠緩解血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮損傷。

血管功能老化是導(dǎo)致高血壓的根本因素。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽能夠誘導(dǎo)活化的血小板與血管性血友病因子(VWF)結(jié)合并黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上[20]，這種相互作用會(huì)引起的內(nèi)皮表面白細(xì)胞的黏附并分泌TNF-α等炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，使得血管內(nèi)皮受到損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮eNOS分泌減少，最終導(dǎo)致血管老化及功能受損而導(dǎo)致高血壓。我們的研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林通過抑制高鹽誘導(dǎo)的血小板活性，抑制炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的血管功能損傷，從而抑制鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展，為鹽敏感性高血壓的防治提供了新的防治思路。但是，高鹽如何導(dǎo)致血小板活化，以及血小板活化后如何通過炎癥反應(yīng)導(dǎo)致高血壓的發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。