慢性腎臟病血管鈣化大鼠血清炎癥因子抗體芯片檢測及分析

康 婷，陳 波，歐三桃*

(1. 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000)

心血管事件是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者的首要死亡原因，血管鈣化是心血管事件的基本病變。近年來認為CKD中的血管鈣化不再僅僅是血清鈣磷水平上升后沉積在血管壁的被動過程，而是一個平滑肌細胞向成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化的主動過程。既往研究表明，系統(tǒng)性及局部炎癥在CKD血管鈣化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，CKD患者不僅可以出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥因子如CRP、IL-6的表達升高，在冠狀動脈鈣化斑塊中也發(fā)現(xiàn)局部促炎系統(tǒng)及促成骨分化的分子表達增加如CD40、CD154、SATB2、galectin-3以及巨噬細胞等[1]。此外，Benz等[2]認為鈣化血管的局部微炎癥不依賴于血清鈣磷水平的變化，有研究發(fā)現(xiàn)炎癥細胞因子對血管平滑肌細胞的成骨細胞樣分化起著重要作用，尤其可以通過影響Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的表達從而調(diào)節(jié)血管鈣化[3]，但目前大多數(shù)研究只是針對單一炎癥因子的檢測及研究。近年來血清炎癥因子抗體芯片的問世可以實現(xiàn)同步、高通量地檢測血清中多項炎癥因子水平的變化。常用來誘導大鼠慢性腎臟病血管鈣化方法主要有單純腺嘌呤、維生素D3聯(lián)合尼古丁或華法林、5/6腎切除等，但往往存在耗時久，成本高，成模率低，死亡率高的風險，阿霉素腎病模型是經(jīng)典的模擬人類腎小球疾病模型之一[4]。因此本研究擬通過聯(lián)合腺嘌呤灌胃和阿霉素尾靜脈注射造慢性腎臟病血管鈣化模型,采用血清細胞因子抗體芯片技術(shù)，觀察和檢測CKD血管鈣化大鼠血清中多種炎癥細胞因子水平的變化，并探討這些細胞因子與血管鈣化的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡SD雄性大鼠30只，體重250～280 g，購自西南醫(yī)科大學城北校區(qū)動物中心[SCXK (川) 2013-17]，于西南醫(yī)科大學城北校區(qū)動物房飼養(yǎng)并取材[SYXK (川) 2013-065]，相對濕度70%，環(huán)境溫度(24 ± 2)℃，光照12 h/12 h明暗交替，每籠5只飼養(yǎng)，并按照3R原則給以人道的關(guān)懷。福利倫理審查證號：20180306114。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(貨號V900471，批號XWBC5614 V，規(guī)格100 g，Sigma)；阿霉素(規(guī)格10 mg，海正輝瑞制藥有限公司)；α-SMA抗體(貨號BS70000，批號AAD44161，規(guī)格50 μL，Bioworld)；Runx2抗體(貨號sc-101145，批號A2918，規(guī)格50 μL，Santa Cruz)；免疫組化試劑盒(貨號SP-0023，批號AH03014880；及貨號SP-0024，批號AG08074831，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Raybiotech試劑盒(上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司提供)；GSR-CYT-3-1芯片(Raybiotech，美國)。自動生化分析儀(美國Beckman)；石蠟切片機(Finesse ME+，Thermo)；倒置相差顯微鏡(Nikon)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及建模

30只SD雄性大鼠，適應環(huán)境1周后給藥。按隨機數(shù)字表法分為兩組：對照組(n=15)和模型組(n=15)。模型組：按照每只大鼠3.0 mg/kg的劑量尾靜脈注射阿霉素，僅在造模第1天給予阿霉素，同時按照150 mg/(kg·d)的劑量灌胃腺嘌呤混懸液，持續(xù)28 d。對照組僅給予同等相應體積的生理鹽水尾靜脈注射及灌胃，持續(xù)28 d。

1.3.2 組織取材與血液、尿液留取

在造模第29天取材，用生理鹽水配成1%戊巴比妥鈉，按照40 mg/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔后下腔靜脈取血，以3500 r/min的轉(zhuǎn)速，離心10 min后取血清，每管500 μL分裝后，部分血清用于測定腎功及電解質(zhì)；部分用于做抗體芯片，剩余血清-80℃冰箱凍存。取雙腎，迅速置于預冷的PBS中，剝除腎筋膜后，一部分置于4%的多聚甲醛中，做常規(guī)石蠟包埋、切片，供病理和免疫組化檢查，另一部份置于-80℃冰箱中備用。沿著心臟動脈弓向下逐漸游離胸腹主動脈，部分用于石蠟包埋切片，部分凍存于-80℃冰箱。

1.3.3 大鼠腎功、血鈣及血磷的檢測

采用自動生化分析儀檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血鈣及血磷。

1.3.4 HE染色

常規(guī)脫蠟復水，蘇木素染5 min后水洗，1%鹽酸酒精分色2 s后水洗，0.5%氨水返藍1 min后水洗，75%乙醇2 s，1%伊紅30 s后水洗，脫水透明封片。

1.3.5 von Kossa染色

常規(guī)脫蠟水化，1%硝酸銀溶液處理，紫外線照射20 min，蒸餾水洗1 min，5%硫代硫酸鈉溶液處理2 min，核固紅復染5 min，常規(guī)脫水，透明，封片。黑色染色為陽性。

1.3.6 免疫組化檢測α-SMA及Runx2表達及分布

60℃孵箱烤片，常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，抗原修復，蒸餾水浸泡5 min，3% H2O2去離子水孵育15 min，正常山羊血清室溫封閉20 min。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3 min × 3次。滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS洗3 min × 3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS洗3 min × 3次，新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，棕黃色或棕褐色為陽性表達。自來水充分沖洗，蘇木素復染20 s，脫水，透明，封片。

1.3.7 天狼星紅染色

常規(guī)脫蠟復水，天狼猩紅染液滴染2 h，水洗，蘇木素染核5 min，水洗，脫水透明封片。

1.3.8 抗體芯片檢測

根據(jù)Raybiotech試劑盒及標準操作流程進行芯片檢測，共檢測27種細胞因子，芯片上每種抗體設置4次技術(shù)重復。對掃描獲取的芯片圖像，使用GenePix Pro 6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)，包括熒光信號、背景等，數(shù)據(jù)分析時首先計算4次重復的均值，以此作為每種因子的信號值，然后以陽性參照進行樣本間信號值的歸一化，最后使用歸一化后的數(shù)據(jù)進行濃度定量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎功及血鈣、血磷指標變化

模型組大鼠BUN、SCr、血鈣、血磷均高于對照組，且差異均有顯著性(P< 0.05；表1)。

表1 兩組大鼠血生化指標Table 1 Blood biochemical indexes of the two groups

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 大鼠主動脈鈣化情況

肉眼觀察，可見對照組大鼠主動脈光滑、柔軟，富有彈性；模型組大鼠主動脈可見明顯的白色鈣化結(jié)節(jié)，呈現(xiàn)出軟骨狀，血管壁僵硬(圖1)。HE染色結(jié)果顯示：對照組血管分層明顯，彈性纖維連續(xù)，血管壁完整；模型組血管中膜層有明顯的彈性纖維斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，血管壁完整性破壞。von Kossa染色結(jié)果顯示：對照組血管無黑色染色，模型組血管中膜層可見明顯廣泛、連續(xù)分布的黑色顆粒沉積，血管壁外膜層及內(nèi)膜層未見黑色顆粒沉積，界限分明，即表明血管中膜層大量鈣化結(jié)節(jié)形成，同時伴有明顯的彈性纖維斷裂，血管壁完整性破壞(圖2)。

注：A：對照組；B：模型組。圖1 兩組大鼠主動脈大體形態(tài)比較Note. A: Control group; B: Model group.Figure 1 Comparison of gross morphology of the in aortas two groups

注：A：對照組；B：模型組。圖2 兩組大鼠主動脈鈣化情況比較(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 2 Comparison of aortic calcification in the two groups

2.3 大鼠主動脈成骨樣分化形成

免疫組織化學結(jié)果顯示：對照組大鼠主動脈上大量表達α-SMA，呈現(xiàn)廣泛均勻分布的棕黃色顆粒，模型組大鼠主動脈上α-SMA表達較對照組明顯減少，顏色變淡；與之相反Runx2在模型組大鼠主動脈壁中膜層表達較多，呈現(xiàn)明顯分布的棕黃色顆粒，而對照組大鼠主動脈壁幾乎無表達(圖3)。

注：A：對照組；B：模型組。圖3 兩組大鼠主動脈免疫組化染色(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 3 Immunohistochemical staining of the aorta in two groups

2.4 大鼠腎病理改變

天狼猩紅染色結(jié)果顯示：對照組腎小球及腎間質(zhì)未見明顯紅色染色，腎小管排列緊密，分布均勻；模型組腎間質(zhì)及腎小球球囊壁周膠原纖維增加，纖維化十分明顯(紅色部分)，腎小球及腎小管管腔擴張，腎小管上皮細胞部分壞死伴管腔內(nèi)有棕褐色的針狀尿酸鹽結(jié)晶沉積(圖4)。

注：A：對照組；B：模型組。圖4 兩組大鼠腎病理比較(× 200)Note. A: Control group; B: Model group.Figure 4 Comparison of the pathological changes in renal tissues of the two groups

2.5 血清抗體芯片分析結(jié)果

與對照組相比，模型組血清中27種細胞因子水平表達的熒光信號發(fā)生顯著變化(表2，圖5)。濃度定量分析顯示：與對照組相比，慢性腎臟病血管鈣化大鼠的血清中炎性因子失衡，促炎因子較抗炎因子明顯增加，其中大部分促炎因子如細胞因子誘導中性粒細胞化學趨化因子(cytokine induced neutrophils chemical chemokines，CINC)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1抑制劑(matrix metalloproteinase-1 inhibitor，TIMP-1)、L-選擇素(L-selectin)及三個抗炎因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)表達顯著上調(diào)，而抗炎因子如白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)和促炎因子如趨化因子(fractaikine)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)有所下降(圖6，圖7)。

注：A：對照組；B：模型組。圖5 血清抗體芯片掃描結(jié)果Note. A: Control group; B: Model group.Figure 5 Serum antibody chip scanning results

表2 GSR-CYT-3-1芯片陣列圖Table 2 GSR-CYT-3-1 chip array map

注：A：對照組；B：模型組。圖6 模型組較對照組表達上升的細胞因子Note. A: Control group; B: Model group.Figure 6 Increased cytokine expressions in the model group compared with the control group

注：A：對照組；B：模型組。圖7 模型組較對照組表達下降的細胞因子Note. A: Control group; B: Model group.Figure 7 Reduced cytokine expressions in the model group compared with the control group

3 討論

慢性腎臟病(CKD)患者并發(fā)血管鈣化不僅導致腎功能進一步減退，還會減少血管順應性、影響冠狀動脈灌注、損害左心室舒張功能。流行病學研究表明80%的CKD 5期患者存在冠狀動脈鈣化，50%的患者冠狀動脈鈣化積分(Agaston評分)> 400，提示高風險心血管事件[5]。對未透析的3～5期CKD患者的一項研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化和嚴重血管鈣化的發(fā)生率分別高達79%和47%[6]。CKD患者并發(fā)血管鈣化機制非常復雜，而反映早期血管鈣化的血清學指標及治療方法的局限等共同增加了血管鈣化的風險。目前國內(nèi)外很多學者認為炎癥可能通過直接或間接的方式參與血管鈣化的形成與發(fā)展，但僅僅檢測了單一或少量的炎性因子，且具體機制尚不明確。

本研究通過給予大鼠150 mg/(kg·d)腺嘌呤混懸液連續(xù)灌胃28 d聯(lián)合首次尾靜脈注射3.0 mg/kg阿霉素，從而造成免疫、代謝復合致病因素所致的腎小球、腎小管復合損傷的慢性腎臟病并發(fā)血管鈣化的動物模型，與人類慢性腎臟病的臨床表現(xiàn)及病理過程相似。血清學指標顯示模型組大鼠有明顯的血肌酐及尿素氮升高(P< 0.01)，同時伴有高磷血癥(P< 0.01)及高鈣血癥(P< 0.05)，腎天狼猩紅染色顯示模型組大鼠腎間質(zhì)及腎小球球囊壁有顯著的腎纖維化病變，以上結(jié)果均表明與對照組比較，模型組大鼠已出現(xiàn)嚴重的慢性腎損害。血管von Kossa染色結(jié)果顯示模型組血管壁中膜彈力層較正常組有明顯的線性沉積的鈣結(jié)節(jié)形成，與既往研究認為CKD主要發(fā)生中膜鈣化相一致[7]。Runx2是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與血管鈣化形成緊密相關(guān)，目前在正常人群、CKD患者、動物實驗以及體外實驗都得到了驗證[8]。本研究的血管免疫組化結(jié)果也顯示模型組較對照組大鼠血管壁中膜層鈣化特異標志物Runx2表達明顯增加，而血管平滑肌細胞特異標志物α-SMA表達下降，表明在血管鈣化的過程中血管平滑肌細胞已發(fā)生成骨樣細胞的表型轉(zhuǎn)換，提示慢性腎臟病血管鈣化大鼠模型建立成功。

細胞因子是炎癥疾病重要的調(diào)節(jié)劑，近年來研究表明炎癥對血管鈣化的致病機制起著重要作用，多種促炎因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6是血管鈣化的關(guān)鍵刺激因素[9]。細胞因子抗體芯片是一項快速發(fā)展的新技術(shù)，可以同時檢測多個細胞因子，研究疾病相關(guān)的細胞因子表達譜，具有高通量、高特異性、高靈敏度、樣品消耗少的特點[10]。因此本研究利用抗體芯片技術(shù)觀察CKD并發(fā)血管鈣化大鼠血清中炎性因子水平表達差異，更加全面地了解炎性因子與血管鈣化的相關(guān)性。芯片分析結(jié)果顯示，模型組的大鼠血清中大部分細胞因子表達增加，其中促炎因子CINC、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TIMP-1、L-selectin及部分抗炎因子GM-CSF、IL-2、IL-10較對照組均有不同程度的升高，抗炎因子IL-4、IL-13及促炎因子fractaikine、IL-1β、TNF-α較對照組降低。促炎因子的大量增加說明血管鈣化過程中發(fā)生了炎癥反應，而重要的抗炎因子IL-2、IL-10的顯著上升說明炎癥反應啟動了抗炎機制，進而導致炎癥因子fractaikine、IL-1β、TNF-α降低，抗炎因子和促炎因子的相互對抗使平衡被打破，致炎因子起到主導作用，抗炎因子作用被削弱，引發(fā)血管鈣化。慢性炎癥是異常軟組織鈣化的中心因素，通常認為血管慢性炎癥與動脈粥樣硬化鈣化相關(guān)[11]。動脈粥樣硬化鈣化主要發(fā)生在內(nèi)膜層，而本研究觀察到CKD并血管鈣化主要發(fā)生在中膜層，提示炎癥可能還與中膜鈣化相關(guān)。Agharazii等[12]在CKD并發(fā)血管鈣化大鼠模型中發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細胞向成骨樣細胞轉(zhuǎn)分化同時，血清促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達也明顯增加。而本研究模型組IL-6上升，IL-1β和TNF-α降低，除了抗炎因子的抑制作用，可能也與血管鈣化的時間段有關(guān)，其機制還有待進一步研究。MCP-1是一種單核細胞趨化因子，多項研究表明，血管鈣化伴隨有血清MCP-1水平增加以及鈣化血管組織MCP-1受體上調(diào)，MCP-1還可影響Runx2的表達，促進血管鈣化的發(fā)生[13 - 15]，本研究也發(fā)現(xiàn)模型組較對照組血清中MCP-1明顯增多，說明MCP-1作為一種促鈣化因子主要與血管平滑肌細胞表型變化相關(guān)。最新研究也發(fā)現(xiàn)臨床終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)患者血清C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)水平增高組與對照組相比，動脈血管中TNF-α和MCP-1表達增加，即表明系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)與局部血管炎癥相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)炎癥可以通過激活mTORC1通路誘導血管收縮表型向成骨表型轉(zhuǎn)化從而加劇血管鈣化的進程[16]。Willy等[17]發(fā)現(xiàn)臨床CKD血液透析患者可以通過改善透析膜增強透析，清除血清中分子的促炎因子如IL-6、TNF-α等從而減輕血管鈣化；類似地，通過選擇性藥物抑制透析患者血清中的IL-1、TNF-α、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)可以防止間充質(zhì)干細胞向成骨細胞表型轉(zhuǎn)換并顯著降低鈣沉積[18]，因此減少血清中促炎因子水平可能會限制血管鈣化的進展，本研究只檢測了CKD血管鈣化模型中血清炎癥因子的水平變化，還需采取干預系統(tǒng)性炎癥的措施以進一步探索防治血管鈣化的新方法。

綜上所述，通過腺嘌呤聯(lián)合阿霉素可以快速、成功地制造慢性腎臟病并血管鈣化的動物模型。血清抗體芯片分析發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病血管鈣化大鼠存在嚴重的炎癥反應，可能與Runx2的激活有關(guān)，促進了血管鈣化的形成，但還需進一步通過血管的局部炎癥反應及炎癥因子受體的檢測明確其相關(guān)性。炎癥反應的激活也提示我們對血管鈣化的檢測傾向于增強或不僅僅局限于傳統(tǒng)危險因素，控制炎癥反應有助于慢性腎臟病血管鈣化的防治。