26 280例結(jié)直腸癌患者MLH1和PMS2基因表達情況及臨床病理特征的多中心回顧性研究

張園園 鄒霜梅 王振寧 韓方海 夏立建 張睿 俞金龍 烏新林趙志勛 王錫山

作者單位：100091 北京，醫(yī)渡云（北京）技術(shù)有限公司醫(yī)學(xué)部1；100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科2；110072 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科3；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胃腸外科4；250014 濟南，山東省千佛山醫(yī)院普外科5；110042 沈陽，遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科6；510280 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院普外科7；010050 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科8；100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科9

張園園, 鄒霜梅, 王振寧, 等. 26 280例結(jié)直腸癌患者MLH1和PMS2基因表達情況及臨床病理特征的多中心回顧性研究[J/CD]. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2019, 8(1): 16-22.

根據(jù)最新的中國癌癥發(fā)病率報告顯示，結(jié)直腸癌位于中國癌癥新發(fā)病例和死亡病例的男性第5位、女性第4位，嚴(yán)重威脅著公眾的健康［1］。在過去的幾十年里，結(jié)直腸癌診療水平飛速提高，這在很大程度上得益于分子病理和基因組學(xué)的發(fā)展，使得醫(yī)師對于結(jié)直腸癌有了更加精確細(xì)致的診斷，從而使不同類別的患者接受更加精準(zhǔn)的治療［2］。

在結(jié)直腸癌多種分子分型當(dāng)中，錯配修復(fù)基因是很重要的一組分子標(biāo)記，包括從1966年林奇發(fā)表了N系和M系家族譜系遺傳病到1984年林奇綜合征、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌專業(yè)命名，再到1993年首次在結(jié)直腸癌患者中應(yīng)用錯配修復(fù)基因?qū)е碌奈⑿l(wèi)星不穩(wěn)定理論來闡述林奇綜合征。1995年以后，全部影響微衛(wèi)星不穩(wěn)定的錯配修復(fù)基因已經(jīng)確定，主要有：MHL1、MSH2、MSH6、PMS2［3-7］。不同組合的缺失不僅能夠很好地預(yù)測患者預(yù)后，同時還影響患者手術(shù)的選擇及對輔助治療的反應(yīng)［8］。錯配修復(fù)基因不僅對于林奇綜合征患者有重要意義，近年來發(fā)現(xiàn)它還對散發(fā)型結(jié)直腸癌患者同樣具有重要意義［9-10］。然而目前仍然缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗證。

另外，隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，大量的研究也已經(jīng)從單打獨斗到信息資源的整合。而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，大數(shù)據(jù)對于疾病的防控和治療具有非凡的意義。通過對既往數(shù)據(jù)的整合和挖掘，可以尋找到全新的發(fā)現(xiàn)，進而指導(dǎo)疾病的早篩和臨床治療策略的選擇。因此本研究基于結(jié)直腸癌大數(shù)據(jù)平臺，回顧性探究了明確診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌且接受手術(shù)切除的患者MLH1和PMS2蛋白的表達情況，探討其與臨床病理特征之間關(guān)系，尋找其內(nèi)部關(guān)聯(lián)，并進一步判定該基因表達在中國結(jié)直腸癌人群中的影響及意義。

資料與方法

一、一般資料

中國結(jié)直腸癌聯(lián)盟是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院牽頭，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、山東千佛山醫(yī)院、遼寧省腫瘤醫(yī)院、內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院、中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院、南方大學(xué)珠江醫(yī)院共同參與的學(xué)術(shù)平臺。本研究納入自2010年1月至2018年12月的患者205 071人次的數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）出院診斷為原發(fā)性結(jié)直腸癌；（2）接受過手術(shù)切除原發(fā)病灶；（3）MHL1、MSH2、MSH6、PMS2免疫組化結(jié)果完整。

二、方法

本研究的數(shù)據(jù)采集依托醫(yī)渡云科研平臺，經(jīng)過各中心倫理委員會批準(zhǔn)，采取免之情同意方式獲取患者除敏感信息外的全量醫(yī)療數(shù)據(jù)，包括電子病例系統(tǒng)、醫(yī)院信息管理系統(tǒng)、檢驗信息管理系統(tǒng)、醫(yī)療影像存檔和通信系統(tǒng)或放射科信息管理系統(tǒng)、移動護理信息系統(tǒng)、重癥監(jiān)護信息系統(tǒng)、手術(shù)麻醉信息管理系統(tǒng)、病案管理系統(tǒng)。檢索有明確診斷結(jié)論（信息來源于病理學(xué)診斷、出院診斷、診斷名稱）為原發(fā)性結(jié)直腸癌。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SAS 9.4（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示，采用卡方檢驗分析其統(tǒng)計學(xué)差異；符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差進行描述，并采用t檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌MHL1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表達情況

在接受了錯配修復(fù)基因檢測的26 280患者中，MLH1缺失率最高，占比4%；其次是PMS2，占比3.25%；MSH6占比2.89%，MSH2占比2.3%。四個錯配修復(fù)基因蛋白存在多種缺失組合，有570人同時存在MLH1和PMS2蛋白表達缺失，占比2.17%；有288人同時存在MSH2和MSH6，占比1.1%。

二、MLH1和PMS2蛋白表達缺失患者的臨床特征

我們首先觀察兩種蛋白在發(fā)生缺失時的臨床病理特征。對于性別而言，男性患者MLH1和PMS2蛋白缺失率高于女性患者：MLH1男性占比55.75%；女性占比44.25%。PMS2男性占比55.13%，女性占比44.87%。在發(fā)病年齡上，MLH1蛋白缺失的患者平均年齡為（61.76±11.94）歲，PMS2蛋白缺失的患者為（61.89±11.86）歲。在MLH1蛋白缺失的患者里，觀察到12人（占比1.12%）伴發(fā)第二原發(fā)癌，而在PMS2蛋白缺失患者里有7人（占比0.96%）。腫瘤大小方面，病灶平均最長徑均值分別是MLH1組（5.84±2.46）cm和PMS2組（5.90±2.55）cm。平均清掃淋巴結(jié)數(shù)目MLH1組（22.67±11.34）個和PMS2組（5.90±2.55）個。MLH1蛋白缺失的患者中，有明確腫瘤家族史患者208人（19.81%），PMS2蛋白缺失的患者172人（22.61%）。從患者腫瘤部位分布情況來看，直腸癌在兩種蛋白表達缺失患者中比例最高，（MHL1占比46.46%和PMS2占比42.45%），其次是右半結(jié)腸癌（MHL1占比27.78%和PMS2占比29.5%），左半結(jié)腸癌占比最低（MHL1占比25.76%和PMS2占比28.06%）。

我們進一步比較其病理分期，按照TNM標(biāo)準(zhǔn)進行分期，首先對于T分期而言，在所有MLH1蛋白表達缺失的1 048例患者中T0期0例（0%），Tis期6例（0.56%），T1期5例（6.18%），T2期118例（11.24%），T3期471例（44.94%），T4期389（37.08%）；對于N分期，N0期638例（60.82%），N1期252例（23.98%），N2期159（15.20%）；M分期中，M0期738例（70.37%），M1期311例（29.63%）。在所有MLH1蛋白表達缺失的1 048例患者中T0期0例（0%），Tis期6例（0.79%），T1期48例（6.29%），T2期78例（10.24%），T3期354例（46.46%），T4期276（36.22%）；對 于N分 期，N0期 450例（59.05%），N1期168例（22.05%），N2期144（18.09%）；M分期中，M0期561例（73.68%），M1期201例（26.32%）。見表1。

三、MLH1蛋白表達情況對結(jié)直腸癌患者臨床及病理特征的影響

與MLH1正常表達的患者相比，MLH1蛋白表達缺失的患者男女比例差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.060，P=0.0045），其發(fā)病年齡小于正常表達組患者（t=4.350，P＜0.0001）。其第二原發(fā)癌的發(fā)病率也高于正常表達組（χ2=60.309，P＜0.0001）。在腫瘤大小方面，MLH1蛋白表達缺失的患者的腫瘤最大徑大于正常表達組（t=7.730，P＜0.0001），同時，清掃淋巴結(jié)總數(shù)目也高于正常表達組。此外，與正常組相比，MLH1表達缺失組呈現(xiàn)明顯家族聚集傾向（χ2=11.605，P=0.001）。而在部位上，不同腫瘤部位MLH1蛋白缺失的發(fā)生率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.047，P=0.049），其中直腸與左半結(jié)腸MLH1蛋白缺失的比例低于正常組，而右半結(jié)腸缺失比例高于正常組。腫瘤T分期方面，不同T分期MLH1蛋白缺失的發(fā)生率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=46.309，P＜0.0001），其中T3的比例缺失組高于正常組，而T4的比例則相反，表現(xiàn)為缺失組低于正常組。而對于N分期和M分期兩組間差異未見統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 患者的病理信息［例（%）］

四、PMS2蛋白表達情況對結(jié)直腸癌患者臨床及病理特征的影響

與MLH1的結(jié)果相似，PMS2蛋白缺失的男女比例低于正常表達組（χ2=7.872，P=0.005），其發(fā)病年齡小于正常表達組患者（t=4.310, P＜0.0001）。第二原發(fā)癌的發(fā)病率也高于正常表達組（χ2=26.790，P＜0.0001）。在腫瘤大小方面，MLH1蛋白表達缺失的患者的腫瘤最大徑大于正常表達組（t=8.550，P＜0.0001），同時，清掃淋巴結(jié)總數(shù)目也高于正常表達組。但是，與MLH1不同的是，PMS2表達缺失組未見呈現(xiàn)明顯家族聚集傾向。而在部位上，右半結(jié)腸MLH1蛋白缺失的發(fā)生率同樣高于正常表達組患者。腫瘤T分期方面，不同T分期MLH1蛋白缺失表達的發(fā)生率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=51.580，P＜0.0001），其中T3的比例缺失組高于正常組，而T2跟T4的比例則相反，表現(xiàn)為缺失組低于正常組。對于N分期兩組間未見統(tǒng)計學(xué)差異。需要格外指出的是M分期中，PMS2蛋白缺失患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低于正常組患者（χ2=5.987，P=0.0008）。見表3。

表2 MLH1蛋白表達情況對結(jié)直腸癌患者臨床及病理特征的影響［例（%）］

討 論

錯配修復(fù)基因在結(jié)直腸癌診療過程中有著非常重要的作用，可對診斷精準(zhǔn)分型，是手術(shù)治療選擇、是否需要輔助化療或放療、預(yù)測化療治療反應(yīng)的重要依據(jù)。目前對于結(jié)直腸癌而言，微衛(wèi)星狀態(tài)作為已判定預(yù)后和判斷部分期別結(jié)直腸癌用藥預(yù)后的重要指標(biāo)，并已經(jīng)寫入指南。而微衛(wèi)星不穩(wěn)定屬于一種基因水平的變異，其根源主要是錯配修復(fù)蛋白功能缺失，目前已經(jīng)有研究證實微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與四種錯配修復(fù)基因的符合率在97.8%。本研究的重大意義在于首次通過臨床大樣本數(shù)據(jù)，對中國人群結(jié)直腸癌錯配修復(fù)基因在結(jié)直腸癌患者蛋白表達缺失狀態(tài)以及與臨床特征之間的關(guān)系進行探討。我們回顧性地分析了中國結(jié)直腸癌聯(lián)盟7家醫(yī)院診斷為結(jié)直腸癌且行腫瘤切除術(shù)的患者的數(shù)據(jù)，利用免疫組化檢測錯配修復(fù)基因蛋白表達缺失情況，分別分析MHL1、PMS2蛋白表達缺失情況與臨床特征之間的關(guān)系。

本文共納入結(jié)直腸癌患者205 071人，其中進行免疫組化檢測錯配修復(fù)基因的患者共26 280人，總體檢測率12.8%。在接受了錯配修復(fù)基因檢測的26 280患者中，MLH1缺失率最高，占比4%；其次是PMS2，占比3.25%；MSH6占比2.89%，MSH2占比2.3%。四個錯配修復(fù)基因蛋白存在多種缺失組合，有570人同時存在MLH1和PMS2蛋白表達缺失，占比2.17%；有288人同時存在MSH2和MSH6，占比1.1%。既往研究顯示西方國家人群錯配修復(fù)基因的缺失率為15%～20%［15］；我國也有報道，其錯配修復(fù)基因缺失率在11.4%［16］，但入組患者只有102例；而西班牙人群錯配修復(fù)基因缺失率僅為4.3%［17］，可以看出不同地域不同人群錯配修復(fù)基因的比例具有很大差異。而對于四種錯配修復(fù)基因MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的突變率，Amira等［18］報道分別為15%、15%、21%和13%，而韓國Kim等［19］研究則為MLH1、MSH2和MSH6缺失率分別是3.7%、2%、5.2%。因此從上述數(shù)據(jù)可以看出，我國及韓國等亞洲地區(qū)結(jié)直腸癌患者錯配修復(fù)基因的蛋白缺失率較低，進一步提示不同人種及地域會影響錯配修復(fù)基因的表達。

表3 PMS2蛋白表達情況對結(jié)直腸癌患者臨床及病理特征的影響［例（%）］

另外，錯配修復(fù)基因是人體內(nèi)的重要體系，能夠維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性與完整性，他們之間與同源的錯配修復(fù)蛋白組成二聚體共同發(fā)揮生物學(xué)功能。其中，MLH1和MSH2為主導(dǎo)蛋白，PMS2和MSH6為配對蛋白，一旦主導(dǎo)蛋白突變，則會引起二聚體的降解，導(dǎo)致主導(dǎo)蛋白與配對蛋白的共缺失。因此MLH1一旦缺失，則會伴有PMS2的缺失。本研究四個基因蛋白表達缺失有兩個以上同時出現(xiàn)的組合中，以MHL1與PMS2同時缺失比率最高，其次是MSH2與MSH6同時缺失。其他組合情況，包括兩個蛋白表達同時缺失、三個蛋白表達同時缺失、四個蛋白表達缺失均可見。從本研究結(jié)果中可以對既往的研究結(jié)果進行進一步的印證。

錯配修復(fù)基因缺失的結(jié)直腸癌具有一定的臨床病理特征，例如：發(fā)病年齡早，好發(fā)于右半，且預(yù)后良好。本研究亦可以大致得出類型結(jié)果，而需要指出的是，雖然在年齡上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從數(shù)值上，兩組均值相差并不大，進一步分析可能是由于在MLH1缺失的患者中，一部分是基因突變原因造成的，另一部分則是由基因甲基化或者BRAF突變所引起的。前者具有明顯的遺傳傾向，所以發(fā)病較早；而后者則不具有遺傳傾向，與散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)病年齡相同，所以兩種情況整合后，會使組間年齡差異變小。除了上述特征，本研究尚發(fā)現(xiàn)MLH1和PMS2表達缺失的患者與正常組相比存在性別上的差別，這種差別在既往研究中雖然未報道，但是在既往的臨床工作中我們也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的規(guī)律，因此下一步有必要進一步探討性別對錯配修復(fù)基因蛋白表達的作用機制。在MLH1與PMS2的患者中，蛋白表達缺失患者合并第二原發(fā)癌的比例均高于蛋白表達無缺失組，同樣地，在合并有第二原發(fā)癌的患者中，蛋白表達缺失患者的比例高于未合并第二原發(fā)癌的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤最長徑均大于蛋白表達正常組患者。提示錯配修復(fù)功能缺陷患者有更大的腫瘤負(fù)荷。

對于病理分期而言，T分期在兩個蛋白表達缺失組和正常組之間均有顯著性差異，進一步分析發(fā)現(xiàn)MHL1與PMS2蛋白表達缺失組患者T0至T2的比例小于蛋白表達正常組患者，而T3至T4的患者比例則大于蛋白表達正常組患者。本研究發(fā)現(xiàn)M分期與PMS2蛋白缺失存在明顯關(guān)聯(lián)，缺失組患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯低于正常組，這在一定程度上能解釋錯配修復(fù)基因突變的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好，與此同時我們也會對PMS2的表達情況與腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制進行進一步研究和探討。

本研究為多中心大樣本回顧性研究，其研究結(jié)果真實可靠，但本研究仍存在以下局限：（1）數(shù)據(jù)有所缺失：所有信息均來自臨床病例材料，研究變量有不同程度的缺失；（2）數(shù)據(jù)不夠規(guī)范：病例書寫的不規(guī)范、檢查報告結(jié)果記錄的不統(tǒng)一等導(dǎo)致可提取的有效數(shù)據(jù)以及可深入分析的指標(biāo)值有限。提示規(guī)范病歷書寫、病理學(xué)取材及報告乃至規(guī)范化的治療流程非常重要；（3）后續(xù)隨訪：其結(jié)果非常重要，如能明確錯配修復(fù)基因蛋白表達缺失及其病理特點與治療及預(yù)后的關(guān)注，那么研究結(jié)果將更有意義。