GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥假陽性與標(biāo)本低水平荷菌量的關(guān)系

劉元 周俊 崔曉利 雷佳媛 趙國連 黨麗云

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的重大公共衛(wèi)生問題，據(jù)WHO統(tǒng)計，2016年全球結(jié)核病發(fā)病患者約為1040萬例，新發(fā)利福平耐藥結(jié)核病(RR-TB)患者60萬例，其中耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者49萬例[1]。結(jié)核病及其耐藥性的早期快速診斷可以有效減少住院診療時間并降低耐藥結(jié)核病的傳播。MTB培養(yǎng)和傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)仍然是診斷結(jié)核病及其耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，但其缺點是耗時較長，從培養(yǎng)到得出藥敏試驗結(jié)果一般需要1～3個月[2]。GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)技術(shù)是一種快速檢測MTB及其利福平耐藥性的分子生物學(xué)檢測方法，其采用實時熒光定量PCR技術(shù)自動進(jìn)行樣品純化、核酸擴增及目標(biāo)序列檢測，最大限度地減少了人工操作，并能夠使樣品間的交叉污染最小化。GeneXpert技術(shù)報告MTB荷菌量時，以“極低(very low)”(28

對象和方法

一、研究對象

收集2016年4月至2017年9月在西安市胸科醫(yī)院就診的2707例疑似肺結(jié)核患者臨床標(biāo)本，其中初治患者2166例，復(fù)治患者541例。包括痰標(biāo)本1945例，肺泡灌洗液標(biāo)本762例。同時進(jìn)行GeneXpert檢測、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960法”)及藥敏試驗，并對GeneXpert檢測利福平耐藥的標(biāo)本進(jìn)行GenoType MTBDRplus檢測(簡稱“MTBDRplus檢測”)。

患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡10～80歲；(2)疑似肺結(jié)核(具有結(jié)核病臨床癥狀：咳嗽、咳痰≥2周，持續(xù)發(fā)熱、盜汗、體質(zhì)量下降等)；(3)胸部X線攝影或CT掃描提示肺結(jié)核可能；(4)HIV陽性不予排除，可納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：針對目前病情已進(jìn)行抗結(jié)核藥物治療超過3周(不包括既往患結(jié)核病有治療史者)的患者。

二、試驗方法

1. 儀器與試劑：(1)儀器：GeneXpert擴增檢測儀(美國Cepheid公司)；BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)(美國BD公司)；GT-blot 48雜交儀(法國梅里埃公司)。(2)試劑：GeneXpert檢測試劑盒(美國Cepheid公司)；MGIT 960液體培養(yǎng)管及分枝桿菌藥敏試驗檢測試劑盒(美國BD公司)；MPT64快速抗原檢測試劑(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)； MTBDRplus試劑盒(法國梅里埃公司)。

2. 標(biāo)本前處理：采用中和離心法去污染處理，痰標(biāo)本和肺泡灌洗液標(biāo)本均采用NALC-NaOH消化液處理15 min，加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)至40 ml，在4 ℃下3000×g離心20 min，棄上清液，沉淀加入1.5 ml PBS振蕩重懸。重懸后的標(biāo)本各取0.5 ml分別進(jìn)行MGIT 960液體培養(yǎng)及GeneXpert檢測，剩余的0.5 ml標(biāo)本暫時凍存于-20 ℃冰箱，待GeneXpert檢測結(jié)果出來后，若顯示耐藥，將這0.5 ml樣本解凍進(jìn)行MTBDRplus檢測。

3. MGIT 960液體培養(yǎng)：參照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]及《MGIT液體培養(yǎng)操作手冊》進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，放入MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。一旦MGIT培養(yǎng)管通過儀器報告呈陽性，使用痰涂片鏡檢確認(rèn)陽性產(chǎn)物，并用MPT64快速抗原檢測試劑確認(rèn)陽性產(chǎn)物為MTB。

4. MGIT 960藥敏試驗：取MTB陽性產(chǎn)物0.5 ml 接種到含藥培養(yǎng)基上(利福平藥物濃度為1 μg/ml，異煙肼藥物濃度為0.1 μg/ml)。另取0.2 ml陽性產(chǎn)物用PBS稀釋100倍后，取0.5 ml接種到生長對照管中，放入MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)[4]。當(dāng)生長對照管中生長單位(growth unit，GU)指數(shù)達(dá)到400時(4～13 d內(nèi))，評估含藥培養(yǎng)管的GU值；含藥培養(yǎng)管的GU值<100為敏感、GU值≥100為耐藥。

5. GeneXpert檢測：依據(jù)GeneXpert檢測說明書進(jìn)行。取0.5 ml前處理后的標(biāo)本至螺蓋管中并加入1.5 ml標(biāo)本處理液，渦旋振蕩30 s，室溫靜置15 min，再將樣本轉(zhuǎn)移至GeneXpert試劑盒后放入擴增儀器的樣本艙中進(jìn)行檢測。

6. MTBDRplus檢測： MTBDRplus技術(shù)是WHO推薦的涂陽肺結(jié)核患者耐藥診斷技術(shù)[5]，本研究中作為第3種檢測技術(shù)對GeneXpert檢測利福平耐藥而MGIT 960檢測利福平敏感的患者進(jìn)行驗證。本研究嚴(yán)格按照MTBDRplus說明書，采用超聲裂解法提取DNA：取0.5 ml處理后的陽性標(biāo)本10 000×g離心5 min，棄上清，加入100 μl高壓滅菌去離子水，95 ℃水浴滅活20 min，在超聲波水浴中超聲裂解15 min，10 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至1個新管中，直接取5 μl上清加入已準(zhǔn)備好的45 μl擴增混合物，擴增程序：首先，95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s；65 ℃ 2 min，共10個循環(huán)。然后，95 ℃ 25 s；50 ℃ 40 s；70 ℃ 40 s；共30個循環(huán)。最后，70 ℃ 8 min。擴增完成后取20 μl擴增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交過程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組間“率和構(gòu)成比”的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GeneXpert檢測和MGIT 960耐藥檢測結(jié)果采用一致性Kappa檢驗，Kappa值≥0.75時認(rèn)為兩者一致性較好。

結(jié) 果

一、GeneXpert檢測臨床標(biāo)本MTB的基本情況

在2707例患者的臨床標(biāo)本中，GeneXpert檢測陰性1522例(56.2%)，檢測結(jié)果錯誤84例(3.1%)，檢測無效10例(0.4%)，檢測無結(jié)果14例(0.5%)，檢測陽性1077例(39.8%)。陽性標(biāo)本中，荷菌量水平“極低”128例，其中對利福平耐藥不確定7例，對利福平耐藥27例(22.3%)；荷菌量水平“低”378例，對利福平耐藥46例；荷菌量水平“中等”370例，對利福平耐藥84例；荷菌量水平“高”201例，對利福平耐藥50例(表1)。

二、GeneXpert檢測對利福平耐藥情況的效能評價

在2707例患者的臨床標(biāo)本中，同時用GeneXpert技術(shù)和MGIT 960藥敏試驗對利福平耐藥性進(jìn)行檢測者有912例。以MGIT 960藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測對利福平耐藥的敏感度為89.4%，特異度為94.7%(表2)。對兩者進(jìn)行Kappa一致性檢驗，Kappa值為0.79，兩者具有較好的一致性。另外，表2還顯示在912例檢測結(jié)果中，GeneXpert和MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平耐藥不一致的結(jié)果共有56例，其中GeneXpert檢測耐藥而MGIT 960藥敏試驗檢測敏感者有40例， GeneXpert檢測敏感而MGIT 960藥敏試驗?zāi)退幷哂?6例。

三、GeneXpert檢測對利福平耐藥的假陽性結(jié)果在4個菌量水平中的分布

以MGIT 960藥敏試驗的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)時，40例GeneXpert檢測耐藥而MGIT 960藥敏試驗檢測敏感的患者即為假陽性結(jié)果。40例患者中，處于“極低”、“低”、“中等”和“高”4個菌量水平的患者分別為10例、6例、14例和10例， GeneXpert檢測對利福平耐藥的假陽性率分別為58.8%(10/17)、16.7%(6/36)、19.2%(14/73)和20.4%(10/49)。對這4個荷菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.981，P<0.05)。對“低”、“中等”和“高”3個菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.192，P>0.05)。對“極低”和“低”2個菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.737，P<0.05)；對“極低”和“中等” 2個菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.083，P<0.05)；對“極低”和“高” 2個菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.819，P<0.05)。這表明在荷菌量為“極低”時，GeneXpert檢測對利福平耐藥的假陽性率與其他3個荷菌量級別的假陽性率進(jìn)行比較明顯偏高。

表1 GeneXpert檢測MTB陽性臨床標(biāo)本荷菌量水平及對利福平的耐藥情況

注對利福平耐藥率=利福平耐藥例數(shù)/(利福平耐藥例數(shù)+利福平敏感例數(shù))×100%

表2 以MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)GeneXpert技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中MTB對利福平耐藥情況的效能評價

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%

四、MTBDRplus技術(shù)對上述“假陽性”結(jié)果的進(jìn)一步檢測

對40例經(jīng)GeneXpert檢測對利福平耐藥而MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平敏感的患者進(jìn)行MTBDRplus檢測，結(jié)果顯示，荷菌量水平為“低”、“中等”和“高”的30例標(biāo)本均為對利福平耐藥，與GeneXpert檢測結(jié)果完全一致。荷菌量水平為“極低”的10例標(biāo)本中，有2例MTBDRplus檢測陰性；8例GeneXpert檢測為陽性者中，有5例MTBDRplus檢測為對利福平敏感，3例檢測為對利福平耐藥(兩者的一致者僅占3/8)。表明在極低荷菌量水平下，GeneXpert檢測可能存在假陽性。

討 論

GeneXpert技術(shù)是一種能夠在2.5 h內(nèi)從臨床標(biāo)本中檢測出MTB及其是否對利福平耐藥的分子生物學(xué)檢測方法。其原理是通過5種顏色的分子探針覆蓋利福平耐藥相關(guān)基因rpoB核心突變區(qū)(RRDR)，當(dāng)檢測區(qū)域有突變時，可導(dǎo)致相應(yīng)的分子探針信號缺失或檢測的Ct值增大(當(dāng)任意兩條探針Ct值差值>4時即判斷為耐藥)[6]。本研究結(jié)果表明，GeneXpert檢測臨床標(biāo)本時存在一定的錯誤率(3.1%)，較印度的研究結(jié)果(4.4%)[7]略低，且存在無效和無結(jié)果的情況，這3種情況在臨床上會增加一定的醫(yī)療成本。

本研究結(jié)果表明，在“極低”、“低”、“中等”和“高”4個荷菌量水平中，GeneXpert檢測對利福平耐藥的耐藥率分別為22.3%、12.2%、22.7%和24.9%。而Singh等[8]的研究表明，MTB對利福平的耐藥率隨著細(xì)菌含量的增加而有升高的趨勢，這與本研究結(jié)果不一致。兩者不一致的原因可能為本研究統(tǒng)計的是不同菌量水平下GeneXpert檢測的對利福平的耐藥率，而Singh等[8]的研究是不同菌量水平下MGIT 960檢測的對利福平的耐藥率。

以MGIT 960藥敏試驗檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，本研究中GeneXpert檢測對利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89.4%和94.7%，這與國內(nèi)外的研究是比較相符的[8-10]。本研究中GeneXpert檢測對利福平敏感的假陰性者16例，對利福平耐藥的假陽性者40例。出現(xiàn)假陰性的原因可能有：(1)存在rpoB核心突變區(qū)以外的其他耐藥突變位點；(2)存在其他對利福平耐藥的機制，比如MTB外排泵基因的過表達(dá)[11]；(3)在同時存在對利福平耐藥和敏感菌株的混合感染中，敏感菌株野生型的基因可以和探針結(jié)合，造成假陰性的結(jié)果[2]。Blakemore等[6]發(fā)現(xiàn)，GeneXpert檢測出對利福平耐藥所需突變菌株的比例與rpoB基因的突變類型有關(guān)，rpoB的第531位點突變較第533位點突變易于檢測。Cayci等[12]也報道，GeneXpert檢測出對利福平耐藥的所需突變株至少要占40%。出現(xiàn)假陽性的可能原因有：(1)rpoB基因耐藥突變區(qū)發(fā)生了同義突變[13]；(2)這些突變株發(fā)生了低水平耐藥，這種情況下，MGIT 960藥敏試驗可能檢測不出耐藥[14-15]；這可能是本研究中GeneXpert檢測對利福平耐藥的假陽性率較高的一個原因；(3)與檢測前應(yīng)用抗結(jié)核藥物導(dǎo)致標(biāo)本內(nèi)MTB生長能力下降有關(guān)，這對GeneXpert檢測結(jié)果影響并不大，但生長能力下降的MTB在進(jìn)行MGIT 960藥敏試驗檢測時可能會誤判為敏感，從而導(dǎo)致GeneXpert檢測的假陽性率升高。

本研究分別以MGIT 960藥敏試驗和MTBDRplus 技術(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，在臨床標(biāo)本荷菌量水平為“極低”時，GeneXpert技術(shù)檢測對利福平耐藥的假陽性率會明顯偏高。這種情況出現(xiàn)的原因可能是GeneXpert檢測rpoB基因的5條探針與靶基因的結(jié)合力不完全相同，當(dāng)荷菌量極低時，探針之間不等效的結(jié)合穩(wěn)定性可能導(dǎo)致其中某條探針檢測的Ct值增大，從而誤判為耐藥。這與Ocheretina等[16]的研究結(jié)果一致。但是，本研究與Ocheretina等[16]的研究仍有兩點不同：(1)Ocheretina等的研究在海地進(jìn)行，與本研究的研究地點在結(jié)核病的發(fā)病率和利福平的耐藥率上均有很大差異。盡管如此，本研究仍顯示，GeneXpert技術(shù)在樣本菌量極低時，檢測結(jié)果會有較高的對利福平假耐藥的情況發(fā)生。(2)在Ocheretina等的研究中，對利福平耐藥不確定者占其“極低”荷菌量患者的27.9%；而本研究中對利福平耐藥不確定者僅占“極低”荷菌量患者的5.5%。另外，本研究結(jié)果還表明，當(dāng)標(biāo)本荷菌量水平在“低”以上時，對于GeneXpert檢測為耐藥而MGIT 960檢測為敏感的菌株，MTBDRplus與GeneXpert的檢測結(jié)果完全一致，這與Chiang等[17]的研究是相符的；這可能與兩種方法都是通過分子探針檢測對利福平耐藥相關(guān)基因rpoB核心突變區(qū)(RRDR)有關(guān)。兩種方法的高度一致性表明，在荷菌量較高時兩種檢測技術(shù)可相互替代，作為診斷肺結(jié)核患者是否為耐藥結(jié)核病的檢測手段。

綜上所述，GeneXpert技術(shù)能夠快速高效地檢測出結(jié)核病患者臨床樣本中的MTB及其利福平耐藥情況，具有較高的敏感度和特異度。但GeneXpert技術(shù)也存在缺點，在檢測臨床標(biāo)本時有一定的出錯率，在細(xì)荷菌量級別為“極低”時，存在無法確定是否對利福平耐藥的情況，且其對利福平耐藥檢測結(jié)果的假陽性例數(shù)明顯偏高，臨床上需要等待表型藥敏試驗結(jié)果或其他方法確認(rèn)后再進(jìn)行用藥。

本研究局限性在于未對16例GeneXpert檢測對利福平敏感而MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平耐藥的患者進(jìn)行第3種檢測方法的分析。在以后的耐藥檢測分析中，還需要通過基因測序或第3種藥敏試驗方法對上述對利福平耐藥及敏感的標(biāo)本同時進(jìn)行平行檢測。