四種實驗室檢測技術(shù)對利福平和異煙肼耐藥性檢測的臨床價值

王鵬森 周剛 蒙昌平 蔣明英 孫強(qiáng)中 葉嗣寬 周刊 黃正谷廖傳玉 張匯征 羅明 楊國強(qiáng) 陳玉 李曉旭 李同心

結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(multi-drug-resistant tuberculosis，MDR-TB)一直是全球性的重要公共衛(wèi)生問題。WHO[1]發(fā)布的《2018年全球結(jié)核病報告》顯示，2017年全球估計仍有1000萬例新發(fā)患者，約157萬例死亡患者；利福平耐藥結(jié)核病(resistant to rifampicin，RR-TB)新發(fā)患者56萬例，MDR-TB患者46萬例，而我國RR-TB患者約為7.3萬例(占全球的13%)。耐藥結(jié)核病是結(jié)核病患者死亡的主要原因，也是HIV感染者面臨的主要?dú)⑹?。MDR-TB的產(chǎn)生和廣泛傳播是結(jié)核病防控工作的巨大挑戰(zhàn)，及時確診耐藥結(jié)核病具有十分重要的意義[2]。

傳統(tǒng)的羅氏藥物敏感性試驗(L-J藥敏試驗，簡稱“比例法”)以培養(yǎng)為基礎(chǔ)，經(jīng)3～8周分離培養(yǎng)菌株后仍需4周左右才能獲得藥敏試驗結(jié)果，耗時較長，不能快速提供可靠的藥敏試驗依據(jù)。實時熒光PCR熔解曲線技術(shù)(簡稱“熔解曲線法”)是在實時熒光定量PCR儀上根據(jù)靶序列熔點的變化檢測靶序列是否含有突變從而獲得耐藥信息，既可以檢測菌株，也可以直接檢測標(biāo)本，檢測周期短。多色巢式實時熒光定量PCR技術(shù)(簡稱“Xpert 法”)是借助GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)在90 min內(nèi)完成對標(biāo)本是否含有MTB及是否對利福平耐藥的檢測方法，方便快捷，但儀器、試劑成本較高。微孔板法是一種基于在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的比例法藥敏試驗新方法，既可縮短試驗時間，亦可測定藥物最低抑菌濃度(MIC)，為臨床用藥種類和劑量的選擇提供參考依據(jù)[3-5]。本研究回顧性分析微孔板等多種方法對利福平、異煙肼耐藥性檢測的結(jié)果，并以比例法藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，評估各種檢測方法的敏感度、特異度等指標(biāo)，以明確微孔板法等藥敏試驗技術(shù)用于快速篩查耐多藥結(jié)核病的臨床價值和意義。

資料和方法

一、資料來源

從醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system，HIS)連續(xù)收集2014年7月至2018年3月重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心收治的確診為結(jié)核病[6-7]，且具有微孔板法、比例法、熔解曲線法和Xpert 法檢測MTB對利福平、異煙肼耐藥性結(jié)果的2792例患者資料；其中微孔板法、比例法采用陽性分離菌株檢測，熔解曲線法和Xpert 法采用患者標(biāo)本直接檢測。納入同時具有微孔板法和比例法進(jìn)行耐藥性檢測的1488例患者作為研究對象，其中341例采用微孔板法+比例法+Xpert法檢測利福平耐藥性，87例采用微孔板法+比例法+熔解曲線法檢測利福平耐藥性，66例采用微孔板法+比例法+熔解曲線法檢測異煙肼耐藥性。

所有患者對檢測方法均知情同意，并經(jīng)重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心學(xué)術(shù)倫理委員會同意批準(zhǔn)。試驗使用的質(zhì)控菌株[MTB標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv)]來源于中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室。

二、主要儀器及試劑

本研究使用的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)(簡稱“MGIT 960系統(tǒng)”)、PAN-TA雜菌抑制劑、分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)及營養(yǎng)添加劑(OADC)均來源于美國BD公司。GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)和配套試劑盒購于美國Cepheid公司。SLAN-96S型實時熒光定量PCR儀來源于上海宏石醫(yī)療科技有限公司。中性改良羅氏培養(yǎng)基、利福平和異煙肼藥敏培養(yǎng)基(比例法)、微孔板試劑盒、噻吩-2-羧酸肼(TCH)和對硝基苯甲酸(PNB)羅氏培養(yǎng)基、微孔板自動加樣儀、微孔板閱讀儀器和相關(guān)軟件均購于珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司。痰處理液、MTB復(fù)合群核酸提取試劑盒、利福平耐藥突變檢測試劑盒(實時熒光PCR熔解曲線法)和Lab-Aid 824型自動核酸提取儀購于廈門致善生物科技股份有限公司。BACspreaderTM1100細(xì)菌超聲分散計數(shù)儀購于廣東體必康生物科技有限公司。MTB分泌蛋白MPB64抗原檢測試劑盒(膠體金法)采購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。

三、標(biāo)本的培養(yǎng)與菌種鑒定

1.標(biāo)本采集：痰液和其他體液標(biāo)本留取參照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》[8]，對于無痰的肺結(jié)核患者可采取霧化引痰或通過纖維支氣管鏡取痰，痰液不合格者需進(jìn)一步對其進(jìn)行指導(dǎo)后重新留取標(biāo)本送檢。腦脊液、胸腹腔積液、病變部位的膿液或手術(shù)過程中取出物、穿刺液等由臨床醫(yī)生采集留取，低溫保存，及時送檢。所有標(biāo)本均為同一天一起送檢，但并不是采用同一份標(biāo)本進(jìn)行檢測。

2.標(biāo)本分離培養(yǎng)：將標(biāo)本按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[9]堿處理-中和離心沉淀法的要求進(jìn)行前處理，離心后的沉淀物用重懸混勻，參照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書將PBS重懸后的沉淀物同步接種于MGIT 960系統(tǒng)和中性羅氏培養(yǎng)基。記錄結(jié)果，并將兩種培養(yǎng)方法中出現(xiàn)任意一種陽性者即判讀為陽性[9]。

3.菌種初步鑒定：膠體金法定性檢測分枝桿菌培養(yǎng)產(chǎn)物中MTB濾液蛋白MPB64抗原，按照試劑盒說明書滴加100 μl處理過的培養(yǎng)樣本，15 min后觀察結(jié)果。若檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶，則判定該菌株為MTB復(fù)合群(陽性)；若檢測線未出現(xiàn)紫紅色條帶，而質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色條帶，則判定該菌株為非結(jié)核分枝桿菌(陰性)。

四、藥敏試驗及結(jié)果判讀

1.比例法：經(jīng)膠體金法鑒定為MTB的菌株，按照文獻(xiàn)[8]采用比例法對利福平和異煙肼的耐藥性進(jìn)行藥敏試驗，本方法中利福平終濃度為40 μg/ml、異煙肼終濃度為0.2 μg/ml；耐藥結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：若耐藥率>1%(耐藥率=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上菌落數(shù)×100%)，則認(rèn)為測試菌株對該藥物具有耐藥性；同時使用TCH和PNB進(jìn)行菌株鑒定的復(fù)檢，TCH、PNB藥物終濃度分別為5 μg/ml、500 μg/ml；復(fù)檢標(biāo)準(zhǔn)：對照管陽性、TCH陽性或陰性、PNB陰性的菌株為MTB復(fù)合群，對照管陽性、TCH陽性、PNB陽性的菌株為非結(jié)核分枝桿菌。TCH、PNB菌種鑒定結(jié)果與膠體金鑒定結(jié)果不一致的患者不納入本研究中。每批藥敏試驗均使用MTB標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv敏感株)進(jìn)行同步室內(nèi)質(zhì)量控制，要求對所有的一線抗結(jié)核藥物(異煙肼、鏈霉素、利福平和乙胺丁醇終濃度分別為0.2 μg/ml、4 μg/ml、40 μg/ml、2 μg/ml)全部敏感。要求接種高稀釋度菌液(10-4mg/ml)，且對照培養(yǎng)基菌落數(shù)不低于20個，否則要求從對照管傳代重新做藥敏試驗。

2.微孔板法：按照試劑盒說明書對含利福平(濃度分別為1、2、4、8 μg/ml)、異煙肼(濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6 μg/ml)、TCH(濃度為0.25 μg/ml)、PNB(濃度為400 μg/ml)的加藥孔、空白對照孔、1/10 參照孔、1/100參照孔進(jìn)行加樣，具體操作：(1)MTB 菌落的準(zhǔn)備：將液體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的MTB菌液離心留取沉淀物用于試驗；對固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的MTB直接挑取菌落用于試驗。(2)1 mg/ml 菌懸液的配置：將細(xì)菌超聲分散儀均勻分散后的菌落懸濁液用含0.5%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(Tween 80)的無菌生理鹽水稀釋至1麥?zhǔn)媳葷釢舛?，即配? mg/ml菌懸液。(3)微孔板加樣：開啟儀器，將含藥微孔板放入儀器；吸取1 mg/ml 菌懸液100 μl加入至10 ml藥敏培養(yǎng)基中，混勻，放入自動加樣儀樣本槽即可開始加樣。空白對照孔、1/10和1/100參照孔均由儀器自動加樣和稀釋。(4)結(jié)果自動判讀：7～10 d后觀察結(jié)果。TCH、PNB菌種鑒定結(jié)果與膠體金鑒定結(jié)果不一致的患者不納入本研究中。

微孔板判讀儀自動判讀結(jié)果原理：孔底出現(xiàn)白色菌體沉淀為陽性，無菌體沉淀為陰性；當(dāng)陽性對照孔為陽性時，記錄的MIC值為無白色菌體沉淀的最低藥物濃度孔；當(dāng)難以判定MIC孔時，將該孔與1/10 參照孔相比較，如該孔沉淀菌體<1/10參照孔沉淀，即可判定生長被抑制。當(dāng)利福平、異煙肼的MIC值分別大于1、0.2 μg/ml，即濃度為2、4、8 μg/ml的利福平加樣孔和濃度為0.4、0.8、1.6 μg/ml的異煙肼加樣孔為陽性時，判為MTB對利福平、異煙肼耐藥，反之判為敏感。

質(zhì)量控制：7～10 d后觀察結(jié)果時，每份試驗樣本中含利福平、異煙肼的加樣孔為陽性時不能有跳孔現(xiàn)象，1/10和1/100參照孔均應(yīng)該有菌落沉淀出現(xiàn)，且1/10參照孔菌落沉淀面積>1/100參照孔，否則需要重復(fù)此試驗。每批次微孔板法試驗均用MTB標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv敏感株)進(jìn)行同步室內(nèi)質(zhì)量控制，要求對4種一線抗結(jié)核藥物(利福平MIC<1 μg/ml、異煙肼MIC<0.2 μg/ml、鏈霉素MIC<1 μg/ml和乙胺丁醇MIC<2.5 μg/ml)全部敏感。

3. Xpert法：為直接標(biāo)本檢測。Xpert法采用6個分子信標(biāo)同時檢測6種探針，其中5個相互重疊的分子信標(biāo)探針(A、B、C、D、E)選擇性覆蓋rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)的81 bp核心區(qū)域，1個探針用作內(nèi)對照，以檢測其是否發(fā)生突變，進(jìn)而判斷是否感染了MTB及是否對利福平耐藥。標(biāo)本處理、上機(jī)檢測均按照GeneXpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)和試劑使用說明書進(jìn)行操作。Xpert檢測結(jié)果由配套軟件系統(tǒng)自動判讀，結(jié)果分為未檢出(陰性)、極低(陽性)、低(陽性)、中等(陽性)、高(陽性)。利福平耐藥檢測結(jié)果分為“耐藥”、“敏感”、“不確定”。本研究不納入檢測結(jié)果為極低(陽性)和耐藥結(jié)果為“不明確”的標(biāo)本。

4. 熔解曲線法：通過直接檢測標(biāo)本中MTBrpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域(RRDR的81 bp核心區(qū)域)內(nèi)的突變進(jìn)行利福平耐藥性篩選，通過檢測MTBahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～-3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)和katG315位密碼子突變與否進(jìn)行異煙肼耐藥性篩選。具體操作如下：標(biāo)本前處理按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[9]堿處理-中和離心沉淀法的要求進(jìn)行，留取離心后的沉淀物，加入1 ml痰處理液，置于100 ℃至10 min。按照提取試劑盒說明書對加熱滅菌處理后的樣本進(jìn)行核酸提取，留取純化后的DNA在離心半徑8.8 cm，13 000 r 的低溫高速離心機(jī)上離心2 min，取上清進(jìn)行PCR試驗。該試驗結(jié)果由配套軟件自動讀取，分為“未檢測到MTB”、“不明確”、“敏感”、“耐藥”。若耐藥結(jié)果為“不明確”，不納入本研究中。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。分別以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，計算微孔板法、Xpert 法、熔解曲線法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值、符合率及Kappa值(0.00～0.20為極低的一致性、0.21～0.40為一般的一致性、0.41～0.60 為中等的一致性、0.61～0.80 為高度的一致性、0.81～1.00幾乎完全一致)。

結(jié) 果

一、各種方法檢測利福平耐藥性的效能分析

以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，微孔板法、Xpert法、熔解曲線法檢測利福平耐藥性的敏感度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為97.2%(731/752)、96.9%(713/736)、97.0%(1444/1488)、96.9%(731/754)、97.1%(713/734)，97.2%(140/144)、94.9%(187/197)、95.9%(327/341)、93.3%(140/150)、97.9%(187/191)，97.1%(33/34)、84.9%(45/53)、89.7%(78/87)、80.5%(33/41)、97.8%(45/46)，見表1。

Xpert法和比例法檢測利福平耐藥性結(jié)果不一致的患者有14例，其中10例比例法結(jié)果敏感，而Xpert法有8例由于未檢測出分子信號探針E而顯示耐藥、1例未檢測到分子信號探針A和D顯示耐藥、1例未檢測到分子信號探針B和E顯示耐藥；4例比例法結(jié)果為耐藥，而Xpert法檢測出全部分子信號探針而顯示敏感。

熔解曲線法和比例法檢測利福平耐藥性結(jié)果不一致的患者有9例，其中8例比例法結(jié)果為敏感，而熔解曲線法有6例顯示rpoB529～533位氨基酸密碼子突變、1例rpoB521～528位點突變、1例提示rpoB521～528位和rpoB529～533位均有氨基酸密碼子突變；1例比例法結(jié)果為耐藥而熔解曲線法未檢測到任何突變。

二、各種方法檢測異煙肼耐藥性的效能分析

以比例法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，微孔板法和熔解曲線法檢測異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為94.8%(751/792)、95.7%(667/697)、97.9%(1418/1448)、96.3%(751/780)、94.2%(667/708)，97.3%(36/37)、86.2%(25/29)、92.4%(61/66)、90.0%(36/40)、96.2%(25/26)，見表2。

熔解曲線法檢測異煙肼耐藥性結(jié)果與比例法不一致的患者有5例，其中4例比例法敏感而熔解曲線法有2例顯示katG315位密碼子突變、1例inhA94密碼子突變、1例ahpC啟動子區(qū)的突變；1例比例法耐藥而熔解曲線法未檢測出異煙肼相關(guān)基因的突變。

表1 以比例法為標(biāo)準(zhǔn)各種技術(shù)檢測利福平耐藥結(jié)果的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特度度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

表2 以比例法為標(biāo)準(zhǔn)各種方法檢測異煙肼耐藥結(jié)果的效能比較

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特度度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

討 論

MDR-TB是全球性嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，快速、準(zhǔn)確、廉價的藥敏試驗是有效防控MDR-TB的首要條件。目前在MTB表型藥敏試驗檢測中主要使用的方法有：MGIT 960法、固體絕對濃度法和比例法，但固體絕對濃度法和比例法所需時間較長，MGIT 960法雖然大大縮短了檢測時間，但其儀器和試劑成本較高，限制了其使用范圍[10-12]。通過這些方法得到的只是MTB菌株對1～2個藥物濃度的藥敏試驗結(jié)果，對其耐藥程度的高低則無法進(jìn)行判定，而微孔板MIC檢測方法恰好可以滿足這一需求，對臨床藥物選擇和劑量選擇有指導(dǎo)意義；而且操作簡單、檢測時間較固體培養(yǎng)基方法快、價格低廉，但較基因型藥敏試驗檢測時間上還是不占優(yōu)勢，現(xiàn)階段臨床上還是采用表型藥敏試驗和基因型藥敏試驗相互補(bǔ)充的方式用于篩查MDR-TB，同時參考藥敏試驗結(jié)果以及藥物MIC值制定患者個體化治療方案。

本研究以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，分析了微孔板法、Xpert法、熔解曲線法對利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能。有文獻(xiàn)報道，相對于比例法，微孔板法檢測利福平、異煙肼耐藥性的敏感度和特異度均為92.3%～100%[13-15]，說明微孔板法檢測利福平、異煙肼耐藥性與傳統(tǒng)的比例法藥敏結(jié)果一致性高，有著較高的可信度和穩(wěn)定性，具有一定的臨床應(yīng)用價值。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)一致，微孔板法對利福平的檢測敏感度[97.2%(731/752)]與Xpert法[97.2%(140/144)]、熔解曲線法[97.1%(33/34)]相當(dāng)，但特異度[96.9%(713/736)]高于其他兩種方法；微孔板法檢測異煙肼的敏感度[94.8%(751/792)]低于熔解曲線法[97.3%(36/37)]，而特異度[95.7%(667/697)]高于熔解曲線法[86.2%(25/29)]，提示當(dāng)臨床醫(yī)生在短期內(nèi)得到基因型藥敏試驗檢測結(jié)果與患者實際情況不一致時，應(yīng)進(jìn)一步追蹤表型藥敏試驗檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。微孔板法檢測利福平、異煙肼耐藥性的符合率[分別為97.0%(1444/1488)、97.9%(1418/1448)]高于熔解曲線法檢測兩藥的符合率[分別為89.7%(78/87)、92.4%(61/66)]，也高于Xpert檢測利福平耐藥性的符合率95.9%(327/341)，說明不同的表型藥敏試驗方法之間其結(jié)果的符合率更高，與文獻(xiàn)[15]報道相近。

本研究結(jié)果顯示，以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，盡管微孔板法檢測利福平和異煙肼耐藥性的Kappa值高于Xpert法和熔解曲線法，可能與表型藥敏試驗、分子檢測等方法的檢測原理不相同有關(guān)，也可能與檢測標(biāo)本類型不相同有關(guān)，比例法和微孔板法檢測的是已分離的菌株，而Xpert法和熔解曲線法直接檢測的是痰液等呼吸道標(biāo)本和其他體液標(biāo)本；但有文獻(xiàn)報道，Xpert法和熔解曲線法直接檢測標(biāo)本MTB的敏感度、特異度均低于直接檢測培陽菌株的敏感度、特異度[16-19]，可能是本研究中兩種方法結(jié)果偏低的原因。但三者Kappa值均大于0.81，說明3種方法耐藥性檢測結(jié)果與比例法高度吻合，均可用于臨床。

盡管熔解曲線法和Xpert法等分子藥敏試驗檢測藥物耐藥性均具有較高的敏感度和特異度，且與比例法、微孔板法藥敏試驗結(jié)果具有很高的符合率[20-22]，但分子藥敏試驗并不能檢出MTB所有表型耐藥菌株，且某些突變的基因位點不一定會引起表型特征改變[22-24]。本研究中9例比例法檢測結(jié)果顯示對利福平敏感，但熔解曲線法檢測到8例rpoB基因突變、1例rpoB533位點突變。4例比例法耐藥性檢測結(jié)果敏感，但Xpert法探針檢測到耐藥位點，分析原因可能與微孔板法自身缺陷有關(guān)，如耐利福平的MTB表型藥敏試驗時在藥物刺激下生長過慢，以及L型耐利福平的MTB在液體培養(yǎng)基里緩慢生長或不生長等導(dǎo)致試驗結(jié)果判斷產(chǎn)生假陰性；也可能與某些耐藥基因突變不影響表型耐藥有關(guān)，如同義突變、核酸序列改變但氨基酸沒有改變，或沉默突變但不影響編碼蛋白的表達(dá)，對結(jié)構(gòu)或功能無顯著影響等[25-26]。而且，即使檢測出耐藥決定區(qū)基因突變也并不能完全代表表型藥敏試驗結(jié)果為耐藥，如表型藥敏試驗檢測耐藥菌和敏感菌混合菌株為耐藥，但其含耐藥菌比例偏低時，可能會導(dǎo)致熔解峰與陽性對照出現(xiàn)一致，將試驗菌株判定為敏感，造成假陰性結(jié)果[17]。另外，Xpert法檢測對利福平敏感的菌株，可能因受異質(zhì)性耐藥或快速生長MTB等的影響而出現(xiàn)比例法或微孔板法檢測結(jié)果呈現(xiàn)對利福平耐藥的結(jié)果。本研究中以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，熔解曲線法檢測對異煙肼耐藥的一致性為0.84，高于檢測對利福平耐藥的一致性(Kappa值為0.79)，可能與該方法檢測異煙肼耐藥性覆蓋的檢測位點較多有關(guān)[27]。

本研究有一定的不足，一是微孔板法、比例法、Xpert法、熔解曲線法檢測的標(biāo)本雖然同時送檢但并不是采用同一份樣本進(jìn)行檢測，二是熔解曲線法因開展不足一年而致患者例數(shù)較少，三是未對微孔板法藥敏試驗與分子藥敏試驗不一致的MTB進(jìn)行測序等，可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)處理存在一定的偏倚。

綜上所述，比例法、微孔板法、熔解曲線法和Xpert 法4種藥敏檢測方法應(yīng)用于臨床檢測利福平和(或)異煙肼耐藥性均具有各自優(yōu)點。相對而言，微孔板法藥敏試驗除了具有較高的敏感度和特異度，還具有操作簡單、檢測時間短、價格相對低廉、能為臨床提供不同藥物MIC值等優(yōu)勢，適合臨床用于快速篩查MDR-TB并指導(dǎo)其合理用藥。