應(yīng)用基因芯片直接檢測(cè)結(jié)核病患者各類標(biāo)本中利福平和異煙肼耐藥的價(jià)值

白雪娟 劉銀萍 張俊仙 王杰 吳雪瓊

我國結(jié)核病的耐藥情況相當(dāng)嚴(yán)重，據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織估算，2017年我國新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬例，在新發(fā)和已治療結(jié)核病患者中耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和單耐利福平結(jié)核病(RR-TB)的發(fā)生率分別是7.1%和24%，是全球30個(gè)MDR-TB高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。MDR-TB是指患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌(MTB)同時(shí)對(duì)一線抗結(jié)核藥物利福平(RFP)和異煙肼(INH)耐受，是目前結(jié)核病臨床治療中亟待解決的難題之一。通過藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)快速診斷MDR-TB，以指導(dǎo)臨床制定合理、有效的化療方案是控制MDR-TB的關(guān)鍵。

目前，臨床上常用的藥敏試驗(yàn)方法主要包括表型方法和分子生物學(xué)方法，均有相關(guān)的商業(yè)化產(chǎn)品。表型方法可同時(shí)檢測(cè)MTB對(duì)10多種抗結(jié)核藥物的耐藥水平，但需要在培養(yǎng)基礎(chǔ)上進(jìn)行檢測(cè)，需較長(zhǎng)時(shí)間；分子生物學(xué)方法通過快速檢測(cè)MTB耐藥相關(guān)基因突變而診斷耐藥，敏感度高，但檢測(cè)的藥物種類有限。這兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在MDR-TB的診斷和治療方面發(fā)揮著重要的作用。筆者通過傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)對(duì)125例培養(yǎng)陽性的臨床標(biāo)本進(jìn)行RFP和INH藥敏試驗(yàn)，了解其耐藥水平；并通過MTB耐藥基因芯片分析臨床標(biāo)本中MTBrpoB、katG和inhA基因突變情況，研究這些耐藥相關(guān)基因突變對(duì)RFP和INH耐藥之間的關(guān)系，探討其臨床意義。

資料和方法

一、患者來源

回顧性調(diào)查2014年8月至2015年9月解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心(原解放軍第三〇九醫(yī)院)全軍結(jié)核病研究所住院患者125例。

二、納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷 》[2]和中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南：結(jié)核病學(xué)分冊(cè)》[3]確診的結(jié)核病患者；(2)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)陽性，并菌種鑒定為MTB；(3)患者的臨床標(biāo)本同時(shí)開展了傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)和MTB耐藥基因芯片檢測(cè)。

三、一般資料

本研究共收集符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核病患者125例，其中男77例，女48例，年齡18～84歲，平均年齡(45.0±19.5)歲。經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢查等確診為肺結(jié)核49例、肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性胸膜炎31例、肺結(jié)核并發(fā)氣管支氣管結(jié)核20例、肺結(jié)核并發(fā)骨關(guān)節(jié)結(jié)核5例、骨關(guān)節(jié)結(jié)核7例、肺結(jié)核并發(fā)淋巴結(jié)結(jié)核3例、泌尿系結(jié)核3例、肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性心包炎2例、血行播散性肺結(jié)核并發(fā)結(jié)核性腦膜腦炎、繼發(fā)性肺結(jié)核并發(fā)腎結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎、腹-盆腔結(jié)核和淋巴結(jié)結(jié)核各1例。其中痰標(biāo)本90例、支氣管灌洗液12例、膿液12例、胸腔積液6例、組織3例、腹腔積液和尿液各1例。對(duì)上述患者的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)和MTB耐藥基因芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.標(biāo)本的培養(yǎng)：根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]，應(yīng)用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速進(jìn)行硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)分枝桿菌鑒別培養(yǎng)，PNB陰性、TCH陽性或陰性的生長(zhǎng)物經(jīng)抗酸染色證實(shí)為MTB或牛分枝桿菌；41 d仍無MTB生長(zhǎng)的報(bào)告為陰性。

2. 絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)：將BACTEC MGIT 960系統(tǒng)快速培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)管離心沉淀，將沉淀物根據(jù)珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司的分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)法)說明書進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，耐藥標(biāo)準(zhǔn)判定：高、低度耐INH分別為1 μg/ml和10 μg/ml；高、低度耐RFP分別為250 μg/ml和50 μg/ml。

3. 應(yīng)用基因芯片檢測(cè)MTB耐多藥基因型：按照博奧生物集團(tuán)有限公司的不同臨床樣本核酸提取試劑盒說明書提取臨床標(biāo)本中的MTB-DNA，然后應(yīng)用分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行核酸檢測(cè)；若MTB核酸檢測(cè)陽性，進(jìn)一步按照晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA微陣列芯片法)的說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增和芯片雜交，檢測(cè)RFP的rpoB和INH的katG及inhA基因啟動(dòng)子的耐藥基因型(圖1)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 應(yīng)用絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)MTB對(duì)RFP、INH的耐藥情況

經(jīng)PNB、TCH鑒別為MTB的125例患者的臨床標(biāo)本，通過絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)同時(shí)對(duì)RFP、INH進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)RFP的耐藥率為20.0% [25/125，其中高耐占88.0%(22/25)、低耐占12.0%(3/25)，高耐的發(fā)生率明顯高于低耐(χ2=25.920，P=0.000)]，INH耐藥率為17.6% [22/125，其中高耐占18.2%(4/22)、低耐占81.8%(18/22)，低耐的發(fā)生率明顯高于高耐(χ2=15.363，P=0.000)]，耐多藥率為16.8%(21/125)，耐多藥/單耐RFP(MDR/RR-MTB)發(fā)生率為20.0%(25/125)(表1)。

12345678910 1234567891011121314QCECBCrpoB IC分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌511 WT(CTG)511(CTG→CCG)513 WT(CAA)513(CAA→AAA)516 WT(GAC)513(CAA→CCA)533 WT(CTG)533(CTG→CCG)531 WT(TCG)531(TCG→TTG)526 WT(CAC)531(TCG→TGG)526(CAC→TAC)526(CAC→GAC)526(CAC→CTC)526(CAC→CGC)516(GAC→GTC)516(GAC→TAC)516(GAC→GGC)NCECQC12345678910 12345678QCECBCBC分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌katG ICinhA ICkatG 315 WT(AGC)inhA-15 WT(C)katG 315(AGC→ACC)inhA-15(C→T)katG 315(AGC→AAC)NCECQC

(1)RFP耐藥相關(guān)的rpoB基因(2)INH耐藥相關(guān)的katG基因和inhA基因啟動(dòng)子

注圖片來自“晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒說明書”。QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針；EC：雜交陽性外對(duì)照探針；BC：空白對(duì)照；NC：陰性對(duì)照探針；IC：內(nèi)對(duì)照探針；WT：野生型。上方和左側(cè)的數(shù)字代表微陣列芯片上的檢測(cè)點(diǎn)，檢測(cè)探針和對(duì)照探針各重復(fù)5個(gè)點(diǎn)

圖1 DNA微陣列芯片上檢測(cè)的MTB耐藥基因型排布示意圖

注耐藥標(biāo)準(zhǔn)判定：RFP高、低度耐藥濃度分別為250 μg/ml和 50 μg/ml；INH高、低度耐藥濃度分別為1 μg/ml和10 μg/ml

表2 125例初、復(fù)治結(jié)核病患者臨床標(biāo)本采用絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)對(duì)RFP和INH的檢測(cè)結(jié)果

125例結(jié)核病患者中，初治和復(fù)治患者分別占73.6%(92/125)、26.4%(33/125)，其絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。初治結(jié)核病患者M(jìn)DR/RR-MTB的發(fā)生率(10.9%，10/92)明顯低于復(fù)治結(jié)核病患者(45.5%，15/33)(χ2=16.060，P=0.000)。

二、RFP和INH耐藥基因型檢測(cè)

應(yīng)用基因芯片檢測(cè)125例MTBrpoB基因、katG基因315位點(diǎn)和inhA基因-15位突變情況見表3，這3個(gè)基因總突變率分別為21.6%(27/125)、14.4%(18/125)、8.8%(11/125)，katG和inhA合計(jì)突變率為22.4%(28/125)。RFP、INH耐藥基因芯片檢測(cè)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和一致率見表4。

以絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照，100例RFP敏感的臨床標(biāo)本中，91例rpoB為野生型，特異度為91.0%(91/100)，發(fā)現(xiàn)rpoB531位TCG>TTG突變7例(7.0%)、526位CAC>TAC和513位CAA>CCA突變各1例；25例RFP耐藥的臨床標(biāo)本中，18例rpoB為突變基因型，敏感度為72.0%(18/25)，其中rpoB531位TCG>TTG突變占77.8%(14/18)，526位CAC>TAC 或CGC 突變占16.7%(3/18)，531位并發(fā)516位GAC>TAC突變占5.6%(1/18)。22例高耐RFP標(biāo)本中，rpoB突變率占72.7%(16/22)；3例低耐RFP標(biāo)本中， 2例rpoB突變率占66.7%(2/3)。125例臨床標(biāo)本中， 531位和526位密碼子突變者26例，其中高耐RFP者占61.5%(16/26)，低耐RFP者占7.7%(2/26)，RFP敏感的占30.8%(8/26)。

以絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照，103例INH敏感的臨床標(biāo)本中，89例katG和inhA均為野生型，特異度為86.4%(89/103)，發(fā)現(xiàn)katG315位AGC>ACC突變7例(6.8%)，inhA-15位C>T突變7例(6.8%)；22例INH耐藥的臨床標(biāo)本中，14例katG或inhA為突變基因型，敏感度為63.6%(14/22)，其中katG315位AGC>ACC突變占71.4%(10/14)，inhA-15位C>T突變占21.4%(3/14)，katG和inhA雙位點(diǎn)突變占7.1%(1/14)。4例高耐INH標(biāo)本中，3例katG和inhA突變；18例低耐INH標(biāo)本中，katG和inhA總突變率為61.1%(11/18)。125例臨床標(biāo)本中，katG和(或)inhA位點(diǎn)突變者28例，其中高耐INH者占10.7%(3/28)，低耐INH者占39.3%(11/28)，INH敏感者占50.0%(14/28)。

以絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照，104例非MDR-TB標(biāo)本中，11例RFP和INH耐藥基因均存在突變，特異度為89.4%(93/104)；21例MDR-TB標(biāo)本中，RFP和INH耐藥基因均突變的發(fā)生率為61.9%(13/21)，只有RFP耐藥基因突變的發(fā)生率為9.5%(2/21)，未檢出耐藥基因突變的發(fā)生率為28.6%(6/21)。

討 論

RFP和INH均是結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)化療方案中的核心抗結(jié)核藥物，如果患者同時(shí)對(duì)RFP和INH耐藥采用標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療無效，就需要按照MDR-TB長(zhǎng)療程的化療方案治療[5]。因此，快速發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者、早期開展有效治療對(duì)于MDR-TB的控制、避免MDR-MTB的播散是至關(guān)重要的。

我國是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，本研究的耐多藥率為16.8%，與高會(huì)霞等[6]的報(bào)道相似(15.0%)。本研究初治結(jié)核病患者M(jìn)DR-MTB的檢出率(7.6%)，略高于2007—2008年我國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(5.7%)[7]和高會(huì)霞等(6.3%)[6]的報(bào)道，但低于《2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告》(簡(jiǎn)稱《流調(diào)報(bào)告》)的數(shù)據(jù)(11.6%)[8]；而復(fù)治結(jié)核病患者M(jìn)DR-MTB的檢出率本研究(39.4%)低于高會(huì)霞等[6]的報(bào)道(44.9%)，但高于2007—2008年我國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告(25.6%)和2010年我國的《流調(diào)報(bào)告》數(shù)據(jù)(35.9%)[8]。本研究初、復(fù)治結(jié)核病患者M(jìn)DR/RR-MTB的發(fā)生率(10.9%、45.5%)均高于2018年WHO的報(bào)道(7.1%、24%)[1]；本研究復(fù)治患者明顯高于全國《流調(diào)報(bào)告》的數(shù)據(jù)，可能是這些患者大多是來自全國各地的難治結(jié)核病患者所致。這些結(jié)果表明復(fù)治結(jié)核病患者的耐多藥率高于初治結(jié)核病患者，獲得性耐藥是我國MDR-TB的主要原因，但原發(fā)性耐藥也不容忽視。

表3 125例臨床標(biāo)本對(duì)RFP、INH采用絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)和耐藥基因芯片檢測(cè)結(jié)果比較

表4 125例結(jié)核病患者以絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)采用耐藥基因芯片檢測(cè)RFP、INH耐藥性的效能

注括號(hào)內(nèi)數(shù)值為藥敏試驗(yàn)不同結(jié)果的總例數(shù)；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=d/(d+b)×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=d/(d+c)×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%=(a+d)/(a+b+c+d)×100%

本研究耐藥基因芯片檢測(cè)與絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因分析如下：(1)兩種方法的檢測(cè)原理不同；(2)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌存在異質(zhì)性耐藥[9]；(3)絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)是對(duì)臨床分離株進(jìn)行分析，而耐藥基因芯片是直接從臨床標(biāo)本中提取核酸進(jìn)行檢測(cè)。本研究應(yīng)用耐藥基因芯片檢測(cè)MTB對(duì)RFP、INH耐藥和MDR的結(jié)果與固體絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)的一致率(87.2%、82.4%和84.8%)低于林明冠等[10]的報(bào)道(93.8%、89.0%和95.5%)和歐維正等[11]的報(bào)道(RFP 93.27%、INH 95.11%)，這可能是因?yàn)楸狙芯渴侵苯訖z測(cè)核酸擴(kuò)增陽性的臨床標(biāo)本中的MTB-DNA，而林明冠等[10]和歐維正等[11]是檢測(cè)MTB分離株的DNA所致。盡管應(yīng)用基因芯片直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB對(duì)RFP、INH的耐藥性較檢測(cè)臨床分離株低，但無需培養(yǎng)環(huán)節(jié)，而顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間(由30 d縮短至1 d)，可為臨床快速提供耐藥結(jié)核病的診斷依據(jù)，是對(duì)傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)的有益補(bǔ)充。

目前，國內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)均證明95%左右的MTB耐RFP是由于RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB507至533位氨基酸密碼子的突變所致[12-13]。李麗等[14]通過PubMed數(shù)據(jù)庫檢索了54篇我國關(guān)于MTBrpoB耐藥決定區(qū)突變情況的研究報(bào)道，分析了我國4149株MTB對(duì)RFP耐藥株的分子特征，結(jié)果顯示531位(52.49%)、526位(24.66%)和516位(9.26%)氨基酸密碼子是最常見的突變位點(diǎn)，與筆者的研究結(jié)論一致(531位、526位突變發(fā)生率分別為77.8%和16.7%)。在我國531位的突變發(fā)生率高于526位密碼子，而國外部分國家526位密碼子的突變發(fā)生率高于531位密碼子[15]。目前研究表明，531位和526位密碼子突變通常導(dǎo)致MTB對(duì)RFP高水平耐藥[16]；筆者的研究結(jié)果顯示，26例531位和526位密碼子突變患者中高耐RFP的占61.5%(16/26)，與該結(jié)論一致。但國內(nèi)外研究均已顯示在表型藥敏試驗(yàn)顯示為RFP敏感的菌株中也發(fā)現(xiàn)有RFP耐藥決定區(qū)突變的現(xiàn)象[17-19]，孟繁榮等[17]通過PubMed數(shù)據(jù)庫檢索36篇關(guān)于MTBrpoB基因突變的研究文獻(xiàn)，其中5136株MTB對(duì)RFP敏感株中，38株(0.74%)存在rpoB耐藥決定區(qū)突變，突變位點(diǎn)包括511、533、531、526、516、518、519、521位等密碼子；本研究100例RFP敏感的臨床標(biāo)本中，9例(9.0%)有rpoB531位(7.0%)、526位(1.0%)和513位(1.0%)突變，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)榛虺聊蛔兓蛘呤莻鹘y(tǒng)藥敏試驗(yàn)不準(zhǔn)確所致[19]。此外，表2結(jié)果顯示初治和復(fù)治結(jié)核病患者單耐RFP的發(fā)生率分別為3.3%和6.1%，而Mukinda等[20]報(bào)道的單耐RFP的發(fā)生率高達(dá)12%。因此，不建議將RFP耐藥作為MDR-TB的標(biāo)志，以免導(dǎo)致不必要的過度治療。

本研究應(yīng)用基因芯片直接檢測(cè)臨床標(biāo)本中MTB對(duì)INH耐藥基因突變的結(jié)果與目前的研究結(jié)論相一致，最常見的突變位點(diǎn)是katG315位密碼子(71.4%)，其次是inhA-15位核苷酸突變(21.4%)，但胡曉紅等[21]報(bào)道的katG315突變率(54.7%)低于本研究，而inhA-15突變率(43.8%)高于本研究，說明不同地區(qū)MTB耐藥基因突變情況存在一定的差異。目前研究表明，katG315位密碼子和inhA-15突變通常導(dǎo)致MTB對(duì)INH低水平耐受或敏感[22]，本研究結(jié)果顯示28例這兩個(gè)位點(diǎn)突變的患者中，低耐INH和敏感者占89.3%(25/28)，與該結(jié)論一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在INH絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)敏感的臨床標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)約13.6%的菌株也存在katG315位和inhA-15位突變的情況，明顯高于胡曉紅等[21]、萬智敏[23]采用比例法與基因芯片檢測(cè)比較的結(jié)果(1.6%～3.3%)，分析其原因如下：(1)katG315位突變只是使其編碼的過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低，仍能將異煙肼轉(zhuǎn)化為其活性型異煙酸[24]，因此，部分轉(zhuǎn)化率降低不是很明顯的菌株在表型藥敏試驗(yàn)中可能表現(xiàn)為敏感；(2)inhA-15 位核苷酸突變通常導(dǎo)致低耐INH，如萬智敏[23]的研究顯示，katG和inhA野生型的MIC值為(0.06±0.05) μg/ml，inhA-15(C→T)突變菌株MIC值為(0.37±0.09) μg/ml,46株KatG315(G→C/A)突變株MIC值為(5.76±4.06) μg/ml；(3)本研究采用含藥的固體培養(yǎng)基進(jìn)行絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)，如果接種菌量較小，也可能會(huì)出現(xiàn)假敏感。

總之，本研究應(yīng)用耐藥基因芯片直接檢測(cè)結(jié)核病患者臨床標(biāo)本中MTB 對(duì)RFP和INH耐藥的相關(guān)基因突變具有中等的敏感度和較高的特異度，可快速檢出對(duì)RFP、INH耐藥和MDR-TB患者，為臨床早期開展有效化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。