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    基因工程小鼠胃癌模型的研究進展*

    2019-02-13 01:36:58黃可婷金多晨黨旖旎張國新
    胃腸病學 2019年11期
    關(guān)鍵詞:化生胃竇胃癌

    黃可婷 金多晨 黨旖旎 張國新

    南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

    胃癌是全球第二大腫瘤相關(guān)死亡原因,5年生存率小于25%[1]。動物模型能模擬體內(nèi)胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)化、侵襲等一系列生物學特性,是研究胃癌及其潛在機制的重要工具。近年來,隨著基因工程和分子生物學技術(shù)的發(fā)展,基因工程小鼠模型的運用越來越廣泛。這種小鼠模型往往用于探究特定基因型與疾病表型的關(guān)聯(lián),極大地豐富了對宿主基因功能和疾病遺傳特征的理解。本文就常見的基因工程小鼠胃癌模型作一綜述。

    一、胰島素-胃泌素(insulin-gastrin, INS-GAS)小鼠

    INS-GAS小鼠是應用最為廣泛的腸型胃癌模型,其轉(zhuǎn)基因序列由人胃泌素編碼序列上游的胰島素啟動子組成。小鼠早期表現(xiàn)為高胃泌素血癥、胃萎縮,隨后向腸化生和異型增生發(fā)展,20月齡時75%發(fā)生胃體侵襲性腫瘤[2]。幽門螺桿菌(Hp)是INS-GAS小鼠的Ⅰ類致癌物,Hp感染后小鼠腸化生明顯加快,且易發(fā)生黏膜內(nèi)浸潤和血管浸潤[2]。由于致癌閾值低,重現(xiàn)性好,Hp感染的INS-GAS小鼠是較為理想的胃體腫瘤模型。

    目前,這種小鼠模型主要用于研究胃癌的發(fā)病機制、干預治療、菌群共生等。Hp感染促進小鼠體內(nèi)胃泌素表達,進而誘導胃上皮細胞尤其是壁細胞凋亡[3]。同時,Hp感染可抑制小鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1(nucleotide-binding oligomerization domain containing 1, Nod1)受體表達,改變巨噬細胞的極化狀態(tài),加重損傷反應[4]。作為藥物治療模型,INS-GAS小鼠已獲得良好的應用。有研究[5]將雌二醇聯(lián)合他莫昔芬治療小鼠胃癌,證實了雌激素信號轉(zhuǎn)導在胃癌中的作用。經(jīng)化療藥物吉非替尼干預后,INS-GAS小鼠體內(nèi)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)受到抑制,提示吉非替尼對胃癌有潛在的治療效應[6]。此外,對不同感染狀態(tài)下INS-GAS小鼠的研究[3]發(fā)現(xiàn),腸道細菌協(xié)同Hp感染可誘導胃癌的發(fā)生。三種腸道細菌(包括ASF356梭菌屬、ASF361乳桿菌屬和ASF519擬桿菌屬混合物)促進INS-GAS小鼠胃部病變,Hp感染可加速病變進展[7]。最近一項評估Hp感染后小鼠胃黏膜譜系變化的研究[8]結(jié)果表明,Hp主要啟動胃中解痙多肽表達型化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia, SPEM),進一步腸道細菌感染可促進凹陷性增生、腸化生和血管侵襲。上述研究結(jié)果提示,Hp誘導INS-GAS小鼠發(fā)生胃癌需要額外細菌的作用,腸道細菌定植可能是胃癌發(fā)生的另一重要原因。

    二、TFF1基因敲除(TFF1-/-)小鼠

    TFF1(又稱pS2)屬三葉肽家族成員,具有黏膜保護和修復的作用。TFF1-/-小鼠最早由Lefebvre等[9]通過同源重組技術(shù)進行構(gòu)建,所有小鼠均發(fā)展為胃竇和幽門腺瘤,30%發(fā)展為多灶性上皮內(nèi)癌或黏膜內(nèi)癌。Hp與TFF1沉默表達具有協(xié)同作用,Hp感染后TFF1-/-小鼠胃腺癌的發(fā)生率顯著增加[10]。體外實驗表明,TFF1能與Hp相互作用特異性結(jié)合人胃黏蛋白,促進細菌在胃黏液層中的定植[11]。該現(xiàn)象解釋了細菌對胃組織的趨向性,但尚缺乏體內(nèi)證據(jù),需進一步研究來闡明兩者之間的關(guān)系。

    TFF1-/-小鼠模型常用于免疫細胞浸潤、信號轉(zhuǎn)導失調(diào)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等促癌機制的研究。與野生型小鼠相比,TFF1-/-小鼠胃竇組織中存在大量T細胞和巨噬細胞,TFF1沉默是胃內(nèi)免疫細胞浸潤的關(guān)鍵步驟[12]。研究表明,多種信號通路通過介導TFF1參與胃癌的發(fā)生。TFF1基因沉默可激活腫瘤壞死因子α/IκB激酶(TNF-α/IKK)途徑,促進NF-κB介導的炎癥反應[13]。通過調(diào)節(jié)AKT-GSK-3β軸,TFF1沉默促進β-連環(huán)蛋白活化,進而誘導腫瘤的形成[14]。在炎-癌轉(zhuǎn)化過程中,EMT與TFF1表達相關(guān)。胃損傷誘導TFF1表達上調(diào),最終觸發(fā)EMT參與黏膜損傷的修復[15]。TFF1在炎癥中表達增高而在腫瘤中表達沉默。最近一項檢測胃黏膜變化的研究[16]發(fā)現(xiàn),Hp急性感染期(<2周)TFF1表達上調(diào)以抑制炎癥;當感染持續(xù)存在時,TFF1表達下降直至沉默。發(fā)生其他消化系統(tǒng)腫瘤(如胰腺腫瘤)時,TFF1-/-小鼠亦可檢測出EMT表型[17]。然而,胃癌中TFF1與EMT之間的關(guān)聯(lián)尚未見報道。

    三、Gp130敲入突變(gp130757F/F)小鼠

    Gp130757F/F小鼠由敲入點突變產(chǎn)生,該突變將細胞內(nèi)gp130 757位置上酪氨酸殘基(Y)轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸殘基(F),可阻斷SHP-2/Ras/ERK信號轉(zhuǎn)導[18]。Gp130757F/F小鼠體內(nèi)TFF1表達缺失,病理表現(xiàn)與TFF1-/-小鼠類似,3個月時進展為胃腺瘤,成瘤率100%[19]。Gp130受體主要觸發(fā)下游三種信號途徑,即JAK/STAT、SHP-2/ERK/MAPK和Src/PI3K/AKT。Hp通過細胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxin-associated gene A protein, CagA)影響不同通路的活性,磷酸化的CagA激活SHP2/ERK,而未磷酸化的CagA激活JAK/STAT3途徑[20]。

    Gp130757F/F小鼠模型主要用于研究gp130配體在炎癥反應、免疫應答和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的信號轉(zhuǎn)導作用。細胞因子白細胞介素11(interleukin-11, IL-11)和IL-6是gp130的主要配體。IL-11通過經(jīng)典途徑激活STAT1/3,是gp130信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵因子[21]。作為潛在的治療靶點,IL-11通過gp130/JAK/STAT3/Bcl-2途徑參與胃癌化療藥物的耐藥作用,靶向IL-11治療可能是克服耐藥的新策略[22]。IL-6在胃竇中的活性較低,與腫瘤侵襲相關(guān),而與腫瘤生長無關(guān)[23]。除炎癥反應外,宿主免疫應答在腫瘤進展過程中亦發(fā)揮重要作用。免疫相關(guān)基因Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)可被STAT3激活,以不依賴炎癥的方式調(diào)節(jié)胃腫瘤細胞增殖和凋亡[24-25]。最新研究[26]還發(fā)現(xiàn),gp130757F/F小鼠胃竇黏膜下層富含淋巴樣的聚集體,其中g(shù)p130/STAT3信號軸可驅(qū)動體內(nèi)胃腫瘤的三級淋巴結(jié)構(gòu)發(fā)展,促進胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Gp130757F/F小鼠遵循經(jīng)典的腸型胃癌發(fā)展序列,與人類腫瘤相似度極高,研究胃癌免疫細胞的免疫效應以及轉(zhuǎn)移和侵襲性表型可選擇該模型。

    四、H/K-ATPase-IL-1β小鼠

    IL-1β是一種多效的促炎因子,具有強烈的抑酸作用。通過抑制細胞內(nèi)鈣離子的釋放,IL-1β可抑制Sonic Hedgehog(Shh)基因表達[27]。Shh是Hedgehog蛋白家族成員,能調(diào)節(jié)胃上皮細胞分化,誘導胃內(nèi)氫-鉀-ATP酶(H/K-ATPase)表達。利用鼠H/K-ATPase啟動子構(gòu)建特異性表達人IL-1β的小鼠模型,即H/K-ATPase-IL-1β小鼠[28]。該小鼠表現(xiàn)為自發(fā)性胃炎、胃萎縮、腸化生,直至進展為胃癌。Hp與IL-1β協(xié)同參與胃腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。與IL-1β作用類似,Hp感染抑制壁細胞Shh表達和H/K-ATPase轉(zhuǎn)錄[27]。敲除小鼠IL-1β基因,Hp感染引起的巨噬細胞和中性粒細胞募集減少,NF-κB活化減少[28]。由此推測,IL-1β可能是Hp感染的最終致病途徑。

    H/K-ATPase-IL-1β小鼠模型目前被廣泛用于研究腫瘤早期的啟動機制、癌相關(guān)成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)以及基質(zhì)細胞在腫瘤微環(huán)境中的作用。通過激活NF-κB途徑,IL-1β募集胃內(nèi)骨髓來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)[28],對早期腫瘤的發(fā)生具有重要作用。至少20%的CAFs來源于骨髓間充質(zhì)干細胞。IL-1β可誘導CAFs中的信號傳導,促進腫瘤向胞外基質(zhì)和淋巴管侵襲[29]。在此過程中,基質(zhì)細胞衍生因子-1募集MDSCs,促進胃異型增生[30]。此外,H/K-ATPase-IL-1β小鼠是檢測胃癌表觀遺傳學變化的重要工具。IL-1β可直接誘導胃腫瘤細胞的DNA甲基化[31],表明炎癥因子可直接觸發(fā)表觀遺傳學變化來促進胃病發(fā)展,揭示了炎癥與胃癌之間的新機制。

    五、其他

    原癌基因K-ras的激活涉及多種惡性腫瘤的發(fā)生。將特異表達于胃頸/峽部的角蛋白19(keratin 19, K19)與K-ras融合,構(gòu)建K19-K-ras-V12突變模型。結(jié)果顯示小鼠3個月時出現(xiàn)泌酸腺萎縮和黏液性化生,20月齡發(fā)生高度異型增生和黏膜下浸潤[32]。另一種K-ras突變模型由CK19CreERT基因插入LSL-K-rasG12D小鼠構(gòu)成,這種小鼠早期出現(xiàn)SPEM、腸化生和胃祖細胞激活現(xiàn)象,與人癌前病變相似[33-34]。因此,具有K-ras突變的小鼠模型常用于研究早期胃癌的分子事件。

    K19-Wnt1小鼠胃黏膜能特異表達Wnt1蛋白、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)和前列腺素E2[35]。K19-Wnt1小鼠與K19-C2mE小鼠雜交生成K19-Wnt1/C2mE小鼠,5周齡時可發(fā)生黏液性化生,20周齡時形成胃腫瘤[35]。這種小鼠模型主要用于探索Wnt途徑、COX-2和血管抑制素2等在胃癌生成中的機制[36]。

    Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子,主要表達于上皮細胞。KLF4敲除(KLF4-/-)小鼠由Villin-Cre+小鼠和Klf4fl/fl小鼠雜交培育而成,病理表現(xiàn)為胃上皮細胞增殖增加和分化改變,35周齡時形成胃竇前腫瘤,80周齡時29%小鼠發(fā)生胃竇腫瘤[37]。這種模型可用于胃竇干細胞誘導的自發(fā)性腫瘤研究。

    六、結(jié)語

    理想的動物模型是研究胃癌發(fā)病機制和改進治療策略的重要前提?;蚬こ绦∈笾苯訉⒄{(diào)控胃癌的特定基因轉(zhuǎn)染至胚胎組織中形成原發(fā)性腫瘤,其腫瘤進展過程和形態(tài)特征與人類腫瘤相似(表1)。這些小鼠對研究基因突變、信號通路、藥物研發(fā)以及藥效評估具有獨特的優(yōu)勢,是極為理想的實驗模型。近年來,基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被用于構(gòu)建各種基因修飾的動物模型。有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TFF-/-小鼠,這種新培育的模型的病理表型與以往研究一致[38]。另一項研究[39]則在gp130757F/F小鼠中敲除凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC),從而探討胃癌發(fā)生的新機制。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的基因工程小鼠模型,可從分子水平進行單基因或多基因的敲除,避免既往單基因突變模型帶來的缺陷,更貼近人類腫瘤發(fā)生的特點,有望成為未來腫瘤研究的主流工具。本文從小鼠模型的造模方式、病理表型、與Hp感染的相關(guān)性、適用領域等角度進行總結(jié),對胃癌的基礎研究具有重要的參考價值。

    表1 基因工程小鼠胃癌模型匯總

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