生物毒性?xún)x的測(cè)試原理及環(huán)境毒性檢測(cè)的應(yīng)用

朱波 吳斌生 謝思琴

摘要：本文介紹了生物毒性?xún)x的儀器裝置與測(cè)試原理、發(fā)光細(xì)菌法毒性?xún)x的應(yīng)用范圍以及生物毒性?xún)x的使用操作與菌種與標(biāo)準(zhǔn)溶液注意事項(xiàng)。本文是實(shí)際操作中的總結(jié)，通過(guò)本文可以便于生物毒性?xún)x的推廣與應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：明亮發(fā)光桿菌T3小種;生物毒性測(cè)試儀;環(huán)境毒性檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：X859 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-672X（2019）11-0-01

Abstract：This paper introduces the instrumentation and testing principle of the bio-toxicity meter， the application range of the luminescent bacteria method， the operation of the biological toxicity meter and the precautions for the strain and standard solution. This article is a summary of the actual operation， through this article can facilitate the promotion and application of biological toxicity instrument.

Key words： Bright luminescent bacterium T3 race; biological toxicity tester; environmental toxicity test

1 儀器裝置及測(cè)試原理

DXY系列生物毒性?xún)x由中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所研制、南京中科院跨克科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)。生物毒性測(cè)試儀是根據(jù)有毒物質(zhì)的毒性對(duì)特殊的發(fā)光細(xì)菌（明亮發(fā)光桿菌T3小種的簡(jiǎn)稱(chēng)）的發(fā)光度具有抑制作用的原理而設(shè)計(jì)的。與其他傳統(tǒng)的水生生物作為生物檢測(cè)方法相比，發(fā)光細(xì)菌法的操作過(guò)程，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、適應(yīng)性強(qiáng)、精度高、用途廣、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。生物毒性?xún)x通過(guò)測(cè)定發(fā)光細(xì)菌發(fā)光度的變化，來(lái)定量被測(cè)環(huán)境樣品中的重金屬、有機(jī)污染物等有毒物質(zhì)造成的急性生物毒性。因此，它是對(duì)受到環(huán)境污染的生物毒性進(jìn)行檢測(cè)與監(jiān)測(cè)較為理想的方法，也是其他領(lǐng)域開(kāi)拓新的實(shí)驗(yàn)測(cè)試方法的手段。最早儀器標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為Q寧/KTS 01-93，經(jīng)過(guò)近二十多年的不斷開(kāi)發(fā)，經(jīng)過(guò)DXY-1型、DXY-2型、到最新的DXY-3型生物毒性?xún)x，已經(jīng)在環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該方法已列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：“GB/T15441-1995水質(zhì) 急性毒性的測(cè)定 發(fā)光細(xì)菌法”由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版[1]。

急性生物毒性的測(cè)試原理：發(fā)光細(xì)菌之所以發(fā)光，是由于它的發(fā)光系統(tǒng)發(fā)生了如下反應(yīng)：當(dāng)細(xì)胞活性高，處于積極分裂狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞中的ATP含量高，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光度會(huì)變強(qiáng);當(dāng)休眠細(xì)胞中的ATP含量明顯下降時(shí)，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光度會(huì)變?nèi)?當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，ATP立即消失，細(xì)菌停止發(fā)光。當(dāng)處于活性期的發(fā)光細(xì)菌，加入有毒物質(zhì)（如重金屬離子Se4+/Cu2+/Cd2+/ Zn2+/Pb2+/As3+，染料、有機(jī)物、農(nóng)藥、酸、堿等），菌體就會(huì)受到抑制甚至死亡，體內(nèi)的ATP含量也會(huì)隨之降低甚至消失，發(fā)光度會(huì)下降甚至到零。由于有毒物質(zhì)的總濃度與發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度呈線性負(fù)相關(guān)變化，因此，可以根據(jù)發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光度來(lái)確定有毒物質(zhì)的急性生物毒性的濃度。若此有毒物質(zhì)知其成分而不知其濃度，則可根據(jù)測(cè)得的相對(duì)發(fā)光度與參比毒物濃度關(guān)系曲線（氯化汞標(biāo)準(zhǔn)曲線）進(jìn)行對(duì)比，即可知道有毒物質(zhì)的濃度。

2 生物毒性?xún)x的應(yīng)用范圍

根據(jù)發(fā)光細(xì)菌法的原理和方法，凡是能干擾或破壞發(fā)光細(xì)菌呼吸、生長(zhǎng)、新陳代謝等生理過(guò)程的有毒有害物質(zhì)，都可以用發(fā)光細(xì)菌法來(lái)檢測(cè)其生物毒性。其主要應(yīng)用包括：（1）對(duì)水、土、氣中化合物的急性毒性的監(jiān)測(cè)與快速評(píng)價(jià);（2）對(duì)水源水與地表水、漁業(yè)水、農(nóng)田灌溉水等水質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè);（3）對(duì)工業(yè)排放的廢水與廢氣，固體廢棄物等急性毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)、監(jiān)控與評(píng)價(jià)以及對(duì)污染源的毒性追蹤與判斷; （4）土壤重金屬與環(huán)境污染物的急性毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)與安全性評(píng)定;（5）對(duì)環(huán)境治理過(guò)程中設(shè)備設(shè)施效果的監(jiān)控。發(fā)光細(xì)菌法的應(yīng)用范圍和前景，隨著環(huán)境學(xué)科的發(fā)展將愈來(lái)愈寬廣。

3 生物毒性?xún)x的使用注意事項(xiàng)

使用生物毒性?xún)x檢測(cè)前需要有一些準(zhǔn)備工作。（1）儀器的預(yù)熱：儀器接通電源至少預(yù)熱15min，調(diào)零，備用;（2）試劑的準(zhǔn)備：氯化鈉，分析純 配制氯化鈉溶液;氯化汞，分析純 配制氯化汞標(biāo)準(zhǔn)曲線;（3）實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備：比色管、蓋子、注射器等是否清洗干凈;（4）環(huán)境條件：室內(nèi)溫度、所有實(shí)驗(yàn)物品都要提前放入溫度控制在20-250C的房間中。

為了提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，生物毒性?xún)x器使用過(guò)程中需要有一些注意事項(xiàng)。（1）環(huán)境溫度及要用到的所有物品都要提前放入20-250C室溫中;（2）菌種的復(fù)蘇一定要用冷藏的氯化鈉溶液及在冰塊中進(jìn)行;菌種復(fù)蘇好后一定要用渦旋儀充分混勻，不可手搖;復(fù)蘇好的菌液只能一次使用完，不能存放;（3）復(fù)蘇好的菌種，用一支預(yù)測(cè)的CK管檢查發(fā)光量，是否滿(mǎn)足測(cè)試樣品的要求，如一檔發(fā)光量不夠可通過(guò)調(diào)檔來(lái)解決;也可以在使用前先拿到光線比較暗的地方，用肉眼觀察是否有微光（熒光）;（4）第一支測(cè)試管加菌液時(shí)，注射器要反復(fù)的來(lái)回吸取菌液幾次，防止有氣泡影響測(cè)試結(jié)果;加菌液時(shí)一定要樣品管和CK管成對(duì)的加菌液（樣品管和對(duì)應(yīng)的CK管）;（5）注射器吸取菌液時(shí)一定要慢慢的吸取菌液，防止過(guò)快菌液吸不上來(lái);（6）加菌液時(shí)注射器的針頭不能伸入到待測(cè)溶液中防止交叉污染，將菌液打在測(cè)試管內(nèi)壁上;（7）蓋上瓶塞，顛倒5次搖勻菌液后要立即拔掉蓋子，所有的管子顛倒次數(shù)一致;加好菌液后的待測(cè)溶液放置不要晃動(dòng);（8）讀數(shù)的時(shí)間很重要，一定要掌握在15min精確到秒;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，最后一支測(cè)試管要記得拿出來(lái)（防止長(zhǎng)時(shí)間不使用儀器，氯化鈉腐蝕儀器）;（9）如果要測(cè)試的樣品比較多，可分批加菌液讀數(shù)后，再加菌液測(cè)試剩余的樣品;（10）測(cè)試管在使用后一定清洗干凈，防止影響下次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

4 生物毒性?xún)x菌種與標(biāo)準(zhǔn)溶液的注意事項(xiàng)

菌種是檢測(cè)過(guò)程中的最關(guān)鍵的因素，需要經(jīng)過(guò)復(fù)蘇。①?gòu)?fù)蘇菌種時(shí)一定要用冷藏的2.5%氯化鈉溶液，把打開(kāi)的菌種安培瓶放入小燒杯中再將小燒杯和菌種放入冰塊中進(jìn)行復(fù)蘇;②在發(fā)光菌活化時(shí)，先加0.5mL的2.5%氯化鈉溶液，視情況（發(fā)光量600mv）再加到1mL;③復(fù)蘇5min后的菌液要充分混勻;

在使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定時(shí)，一般使用氯化汞作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。（1）氯化汞試劑一定要是分析純級(jí)，不能含酸;（2）如果氯化汞試劑放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，請(qǐng)多烘幾遍，再配制標(biāo)準(zhǔn)溶液;（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液的母液可放置在冰箱中保存，但是，時(shí)間也不能過(guò)長(zhǎng);（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，否則，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大;（5）氯化汞標(biāo)準(zhǔn)曲線在每次做實(shí)驗(yàn)時(shí)都需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不能使用前一次使用過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。而且這些稀釋液保存期不得超過(guò)24h，過(guò)期請(qǐng)務(wù)必重配！

參考文獻(xiàn)

[1]“GB/T15441-1995水質(zhì) 急性毒性的測(cè)定 發(fā)光細(xì)菌法”由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版.

收稿日期：2019-06-15

作者簡(jiǎn)介：朱波（1984-），女，漢族，本科，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)室分析與管理工作。