土壤耐鉻細(xì)菌的篩選及特性研究

陳少金 劉仕柏 梁健敏 彭昌盛 姜學(xué)霞

摘要：本項目從土壤微生物生態(tài)修復(fù)的角度，利用細(xì)菌分離培養(yǎng)的研究方法，對重金屬鉻（Cr）污染土壤的微生物的生態(tài)效應(yīng)和重金屬鉻修復(fù)作用進(jìn)行研究，探究功能菌對Cr6+的轉(zhuǎn)化機(jī)理和響應(yīng)機(jī)制，為微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：農(nóng)田土壤;重金屬;微生物;鉻

中圖分類號：X131.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2019）12-00-02

Abstract：In this project， from the Angle of the soil microbial ecological restoration using bacteria cultivation methods， chromium （Cr） of heavy metals by heavy metals pollution in soil microbial ecological effect and action of chromium to study， to explore the function of microbes the transformation mechanism of Cr6 + and response mechanism， which will provide a scientific basis for the application of bioremediation.

Key words：Farmland soill;Heavy metal pollution;Microorganism;Cr

在土壤污染問題中，重金屬污染是治理之重。土壤中六價鉻污染的主要來源是電子產(chǎn)品拆解工廠在拆解作業(yè)中，沒有進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，從而?dǎo)致產(chǎn)品內(nèi)部的重金屬鉻釋放到土壤環(huán)境中去，或者合金冶煉過程中產(chǎn)生的鉻酸煙霧，經(jīng)過重力沉降進(jìn)入土壤中，以及制革工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的剩余制革污泥因處理不當(dāng)?shù)仍蜥尫诺酵寥拉h(huán)境中去。重金屬鉻污染對土壤生態(tài)系統(tǒng)的危害巨大[1]。土壤中的重金屬鉻與人類健康和動植物生長狀況緊密相關(guān)，Cr是生物生長發(fā)育過程中必須的微量元素之一。適量的鉻可以促進(jìn)生物的生長，但同時鉻屬于五毒元素之一，若土壤環(huán)境中的重金屬鉻嚴(yán)重超標(biāo)，植物體內(nèi)的葉綠素結(jié)構(gòu)會被破壞，導(dǎo)致植物生長不良;另一方面高濃度的重金屬鉻可能會通過食物鏈和食物網(wǎng)最終進(jìn)入人體，對人體具有致癌、致畸變、致突變的作用[2]。另外，鉻污染導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，嚴(yán)重破壞了土壤環(huán)境的生態(tài)平衡。

利用土壤微生物對重金屬的吸附和還原作用，可用于吸附土壤中的重金屬鉻或?qū)⒍拘暂^強(qiáng)的六價鉻還原為毒性較弱的三價鉻，某些功能微生物對重金屬鉻污染具有一定的耐受程度，可利用微生物吸附及富集、降解、氧化還原和降毒等機(jī)理使得土壤中的重金屬轉(zhuǎn)化為遷移性能差，毒性低的狀態(tài)[3]。土壤重金屬污染的傳統(tǒng)治理方法多樣，相比之下，微生物法治理具有更高的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，微生物修復(fù)土壤重金屬對土壤理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)影響相較于物理、化學(xué)和物理化學(xué)等技術(shù)小。微生物具有個體小、繁殖速度快、代時短數(shù)量大等優(yōu)點，有利于微生物的培養(yǎng)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，可培養(yǎng)和馴化出對某種重金屬處理效率高和具有針對性的功能微生物，不會對土壤造成二次污染，修復(fù)過程是可持續(xù)的，有利于維護(hù)土壤生態(tài)平衡。從經(jīng)濟(jì)的角度而言，由于微生物增殖速度快，微生物修復(fù)技術(shù)成本低，具有較大的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 采樣

利用梅花形布點法采集距離地面0～20 cm耕作層土壤，將在一個采樣單元內(nèi)各采樣點采集的土樣混合均勻制成混合樣，利用四分法棄取，最后留下1 kg裝入樣品袋中，并貼好標(biāo)簽帶回實驗室進(jìn)行土樣預(yù)處理。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干、磨碎、過篩、混合、分裝，進(jìn)行化學(xué)分析。將風(fēng)干的土樣在有機(jī)玻璃板或在木板上用錘、棍、棒壓碎，并除去碎石、砂礫及植物殘體后，用四分法分取所需土樣量，使其全部通過20目孔徑尼龍篩。過篩后的土樣全部置于聚乙烯薄膜上，充分混勻，采用四分法兩兩混合分成兩份，一份放于樣品庫存放，用于土壤pH、土壤交換量等項目的測定;另一份繼續(xù)采用四分法兩兩混合縮分成兩份，一份備用，另一份充分研磨至全部通過60目孔徑尼龍篩，充分混合均勻后備用。

1.2 土壤Cr6+的測量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照二苯碳酰二肼分光光度法。取9支50 mL比色管，依次加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00和10.00 mL鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液（每毫升標(biāo)準(zhǔn)使用液含1.00 μg Cr6+），用蒸餾水稀釋至標(biāo)線，加入（1+1）硫酸0.5 mL和（1+1）磷酸0.5 mL，搖勻。加入2 mL顯色劑溶液，搖勻。顯色5～10 min后，于540 nm波長處，用1 cm比色皿，以水為參比，測定吸光度并作空白校正。以吸光度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)Cr6+含量為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

1.3 功能菌的篩選、馴化與鑒定

利用牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌）進(jìn)行耐鉻細(xì)菌的分離純化，采用梯度稀釋法分離目的菌株，然后采用平板劃線法來純化菌株直至出現(xiàn)單個菌落為止（圖2）。將單個菌落菌株接種到1mg/L Cr6+離子的液體培養(yǎng)基中，然后置于30℃，135r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，篩選出耐鉻菌作為種子液。取0.25mL的1g/L的Cr6+溶液到250ml帶棉塞錐形瓶中并加入249.75 mL的液體培養(yǎng)基即配成濃度為1mg/L Cr6+離子的液體培養(yǎng)基，按此方法配制濃度分別為10mg/L、20mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L……250 mg/L、300 mg/L的一系列液體培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)出來的種子液菌株分別接種到濃度梯度液體培養(yǎng)基上，然后置于30℃，135r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，記錄菌株最高耐受度。本實驗篩選出兩株功能菌，分別命名為1號（白色菌落）和2號（紅色菌落），最后進(jìn)行冷凍保存，主要研究了2號紅色功能菌對20 mg/L和 40 mg/L濃度的Cr6+離子的去除效果。