含油污泥中芘降解菌的篩選及代謝活性研究

陳麗 任宏洋 文天祥 段欣欣 雷杰霞 李佳穎

摘要：以多環(huán)芳烴芘為唯一碳源對含油污泥中微生物進行富集，篩選出高效降解芘的菌株。菌株形態(tài)為桿狀，其菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓球狀，生理生化鑒定結(jié)果表明為分支桿菌屬。代謝活性研究表明，菌株在芘濃度為150mg/L、溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)7d后，對芘的降解率可達到39.2%左右，OD600生長曲線表明該菌株在16h后進入對數(shù)生長期，其穩(wěn)定期時間大約持續(xù)40h，其呼吸速率曲線趨勢與生長曲線具有一致性，菌株代謝過程導致培養(yǎng)液pH有所升高。

關鍵詞：芘降解菌;菌株篩選;菌株鑒定;抗酸染色

中圖分類號：X131 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2019）11-00-02

Abstract：Using pahs pyrene as the only carbon source， the microorganisms in the oily sludge were enriched and the strains were screened to degrade pyrene effectively.The shape of the strain was rod， and its colony shape was round ball.Metabolic activity of the research shows that the strain in pyrene concentration of 150mg/L， temperature 30℃， the speed of 150r/min training after 7 d， degradation rate can reach about 39.2% of pyrene， OD600 growth curve showed that the strain after 16h into the logarithmic phase， the stabilization time lasts about 40h， the respiratory rate curve trend consistent with growth curve， strain metabolic processes leading to culture medium pH was increased.

Key words：Pyrene degrading bacteria;Strain screening;Identification of bacterial strains;This acid fast stain

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons ，PAHs）是具有2個及以上苯環(huán)組成的芳香烴化合物，具有強烈的致癌、致畸和致突變效應[1][2]。PAHs隨著苯環(huán)數(shù)的增加毒性增強[3]，目前已經(jīng)被聯(lián)合國列為持久性有機污染物[4]。芘含有四個苯環(huán)，在污染環(huán)境中易富集、含量高，與低分子量PAHs相比更不易有效去除[5]，是多環(huán)芳烴的代表物，也是監(jiān)測PAHs污染的標志物[6]。

微生物降解技術(shù)作為一種經(jīng)濟有效的方法，是當前PAHs降解的研究熱點[7]。常見的多環(huán)芳烴降解菌有鞘氨醇單胞屬、分枝桿菌屬、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌菌屬和伯克氏菌屬等[8]，這些高效降解菌大多從被多環(huán)芳烴污染的土壤或沉積物中分離出來[9]。不同于細菌，真菌是通過分泌胞外酶來降解高毒性的多環(huán)芳烴，其中最常見的是白腐真菌[10]。目前低分子量多環(huán)芳烴的降解菌的研究受到廣泛關注，但對于高環(huán)PAHs高效降解菌的研究就相對較少[3]。本研究以芘為唯一碳源和能源，從含油污泥中富集分離多環(huán)芳烴高效降解微生物，研究其代謝特性，為多環(huán)芳烴微生物修復技術(shù)應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤采自四川某油田含油污泥暫存池中的土樣，將表面大約5cm的土層去掉，用滅過菌的鐵鏟采集5-10cm的土樣，裝入無菌塑料袋中，密封后于4℃的低溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：1.5g牛肉膏，2.5g蛋白胨，2.5gNaCl，1L蒸餾水，pH=7;

無機鹽液體培養(yǎng)基：K2HPO4 4g，Na2HPO4 4g，（NH4）2SO4 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2 1mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1mg，蒸餾水1L，pH=7。

1.1.3 實驗儀器

本研究所用的主要儀器設備包括：立式高壓蒸汽滅菌鍋（LDZF-30L，上海申安）、全溫氣浴微生物培養(yǎng)震蕩床（QYC-200，上海褔瑪）、超凈工作臺（SJ-CJ-2FD，蘇州蘇潔）、人工氣候培養(yǎng)箱（RPX-350A，上海?，敚?、高效液相色譜（LC-20A，日本島津）、微生物降解呼吸儀（AER-208，美國CHALLENGE）、可見光分光光度計（723N，上海佑科）、雙目顯微鏡（M150，麥克奧迪）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定

菌株的富集培養(yǎng)：取5g含油污泥加入100mL蒸餾水，在震蕩床振蕩12h后靜置取其上清液。在振蕩速度為150r/min、恒溫30℃的搖床中培養(yǎng)3～4d。

菌株的分析：從培養(yǎng)液中取出1mL菌液加入到含芘的無機鹽培養(yǎng)液中，梯度馴化培養(yǎng)15d，進行平板劃線，培養(yǎng)3～4d，待菌落長出置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將已純化的菌種接種至含芘的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)一周，觀察菌種生長范圍定性選出最優(yōu)菌種。

菌株生理生化特性研究：在光學顯微鏡下觀察最優(yōu)菌菌株形態(tài)，進行革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗、淀粉水解實驗、葡萄糖發(fā)酵實驗、V-P試驗、M-R試驗、吲哚實驗、反硝化等實驗，利用苯酚品紅染液對該菌進行抗酸染色，進一步驗證菌株的特性。

1.2.2代謝活性

菌株生長速率及呼吸速率：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，每2h測定一次該菌的OD600，趨于穩(wěn)定后每4～5h測定一次，當OD600值有明顯下降時停止測定，并用呼吸速率儀測定呼吸速率。菌株降解性能測定：采用高效液相色譜（LC-20A，日本島津）測定分離的微生物對于芘的降解效率，同時測定該菌在7d生長過程中pH變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

取250mg/L芘濃度下培養(yǎng)的菌液于含芘無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4d后，分離純化得到三種類型菌落，表觀特征分別為為乳白色、橙黃色和橙紅色菌落。根據(jù)三種菌株在含芘培養(yǎng)基上的生長情況，定性得出橙黃色菌株對芘的耐受性最好。通過顯微觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株呈桿狀，革蘭氏染色為陽性、通過抗酸染色實驗發(fā)現(xiàn)，該菌株抗酸染色呈陽性，該菌株生理化鑒定結(jié)果如表1所示。三種菌株皆屬于好氧菌，過氧化氫酶、葡萄糖發(fā)酵、吲哚實驗均表明三種菌株為陽性。

橙黃菌株形態(tài)為桿狀，好氧菌，產(chǎn)色素。且相關資料表明，降解多環(huán)芳烴這類物質(zhì)的桿菌主要為芽孢桿菌、蒼白桿菌、分支桿菌。根據(jù)顯微觀察，并未發(fā)現(xiàn)該菌有芽孢出現(xiàn)，故排除芽孢桿菌的可能。蒼白桿菌為革蘭氏陰性菌，而該菌為革蘭氏陽性，故排除蒼白桿菌的可能。且實驗結(jié)果顯示，菌株抗酸染色呈陽性，再結(jié)合生理生化指標鑒定和革蘭氏染色鑒定，綜上所述，可初步鑒定出該菌株屬于分枝桿菌屬，命名為MYC-1。

2.2微生物在芘降解過程的生長代謝活性研究

2.2.1OD600和OUR

針對篩選出芘高效降解菌MYC-1菌株，測定其在以芘為唯一碳源的培養(yǎng)基中，采用OD600表征菌體的濃度，菌體的生長速率及好氧呼吸速率，如圖1所示。

由圖可知，在0～12h內(nèi)，MYC-1菌株生長曲線較為平緩，此時為MYC-1菌株的適應期。在12～28h內(nèi)OD600值迅速上升，此為MYC-1菌株的對數(shù)生長期，在此時間范圍內(nèi)MYC-1菌株數(shù)量增長速率最快，菌株濃度增長約97.86%。在28～50h內(nèi)又趨于平緩，進入到穩(wěn)定期，該時期持續(xù)時間相對較長，在22h左右。在50～70h內(nèi)，OD600值逐漸下降，說明細菌活性開始減弱，此時MYC-1菌株進入衰亡期。同步測量培養(yǎng)過程中MYC-1菌株的呼吸速率，結(jié)果表明在0～40h氧消耗速率速率呈上升趨勢，在40h時達到最大，接近1.1mL/h，40h后，氧消耗速率緩慢下降，但趨于穩(wěn)定，大約在0.9～1.0mL/h區(qū)間內(nèi)，持續(xù)到110h，呼吸速率急劇下降。因此可以得出在40h時MYC-1菌株的呼吸速率最大，活性最大，對比微生物濃度變化和氧消耗速率變化表明，微生物的生長速率和呼吸速率具有較好的一致性。

2.2.2 pH變化

MYC-1菌株代謝過程中，培養(yǎng)基中pH變化如圖2所示。

由圖2可知，最初培養(yǎng)基的pH為7左右，培養(yǎng)液的pH隨著時間的增加不斷升高，結(jié)果顯示在MYC-1菌株的生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物呈堿性，培養(yǎng)152h后，pH達到8.92，與最開始相比pH升高2 左右。

2.2.3 多環(huán)芳烴芘降解率的測定

連續(xù)測定MYC-1菌株在7d內(nèi)對芘的降解過程，如下圖3所示：

結(jié)果顯示，在芘濃度為150mg/L的條件下，MYC-1菌株在第1d和第2d降解率均為10%以下，從第3d開始降解率有比較大幅度的提升，在第5d達到34.41%后，降解率上升的趨勢開始減緩，第7d，MYC-1菌株對芘的降解率達到39.20%左右。菌株生長初期需要適應含芘的條件，生長活性相對較低，對芘的降解效率為6.36mg/d;當菌株進入對數(shù)增長期，活性較高，對芘的降解達到16.28mg/d。當進入衰亡期后，活性降低，對芘的降解僅為3.6mg/d。田晶等人[3]發(fā)現(xiàn)的一株黃曲霉菌，在50mg/L條件下，3d內(nèi)對芘的降解率為71%，降解速率為11.83mg/d，本研究篩選的MYC-1菌株，在較高的初始芘濃度條件下，降解速率相對較高，顯示了MYC-1菌株具有較高的代謝活性和對于多環(huán)芳烴芘毒性的耐受能力。

3 結(jié)論

（1）從含油污泥中，經(jīng)過富集分離純化等操作，篩選得到一株對芘有一定降解性能的菌株，在芘濃度為150mg/L、溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)7d后，對芘的降解率可達到39.2%。

（2）通過顯微鏡發(fā)現(xiàn)該菌株形態(tài)為桿狀，其菌落形態(tài)呈圓球狀，通過生理生化指標發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陽性好氧菌;抗酸染色呈陽性，初步判別該菌株為分支桿菌屬。

（3）該菌OD600生長曲線表明菌株在16h后進入對數(shù)生長期，其穩(wěn)定期時間大約持續(xù)40h，呼吸速率曲線趨勢與生長曲線具有一致性，且在菌株生長過程中培養(yǎng)液pH呈上升趨勢。

參考文獻

[1]馬靜. 多環(huán)芳烴降解菌的篩選、降解機理及降解性能研究[D].大連理工大學，2013.

[2]Wei Qin， Fuqiang Fan， Yi Zhu， et al. Anaerobic biodegradation of benzo（a）pyrene by a novel Cellulosimicrobium cellulans CWS2 isolated from polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil Brazilian Journal of Microbiology， 49（2018）， pp. 258-268.

[3]田晶，徐小琳，康彥順，湯偉華，劉思琪.廣譜性多環(huán)芳烴降解真菌Aspergillus flavus AD-X-1的篩選及其性能研究[J].生物技術(shù)通報，2018，34（08）：115-122.

[4] 趙金平.我國持久性有機污染物監(jiān)測現(xiàn)狀、存在問題及對策分析[J].環(huán)境與發(fā)展，2019，31（05）：55-56.

[5]Ashis K ， Mukherjee， Pabitra Bhagowati ， et al. A comparative intracellular proteomic profiling of Pseudomonas aeruginosa strain ASP-53 grown on pyrene or glucose as sole source of carbon and identification of some key enzymes ofpyrene biodegradation pathway Journal of Proteomics，167（2017）， pp. 25-35.

[6] 黃興如，張彩文，張瑞杰，章俊，張曉霞.多環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定及降解特性[J].微生物學通報，2016，43（05）：965-973.

[7] 思顯佩. 多環(huán)芳烴降解菌的生長特性及其在土壤修復中的應用[D].重慶工商大學，2011.

[8] 楊曉磊，陸貽通，曹林奎.多環(huán)芳烴熒蒽降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J].科技通報，2007（01）：46-51.

[9] 吳梟雄，王紅旗，劉自力.多環(huán)芳烴污染土壤的微生物修復技術(shù)研究進展[J].環(huán)境與發(fā)展，2018，30（07）：108-109.

[10] 湯云春，尤朝陽，張淑娟，許學峰，徐海陽，張俐.白腐真菌芘降解特性及其與細菌的協(xié)同降解[J].環(huán)境科學與技術(shù)，2018，41（10）：34-41.

收稿日期：2019-08-27

基金項目：四川省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201910615022）

作者簡介：陳麗（1996-），女，漢族，本科在讀，研究方向為環(huán)境工程。