MicroRNA在針灸研究中的應(yīng)用與進(jìn)展

宋立新,陳采陶,陳艷焦,張雪,尹磊淼,2,王宇,2,楊永清,2,徐玉東,2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030)

針灸治療疾病在中國已有上千年的歷史,自20世紀(jì)70年代早期開始,由于針刺鎮(zhèn)痛的顯著療效及應(yīng)用,針灸引起了全球廣泛關(guān)注,被越來越多的國家所使用,同時(shí)針灸作用機(jī)理的研究在世界范圍內(nèi)陸續(xù)開展,采用了諸如神經(jīng)示蹤、紅外線攝影、核磁共振成像、生物化學(xué)分析等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)探索傳統(tǒng)針灸療法的科學(xué)內(nèi)涵,并提出了各種假說。然而,關(guān)于針灸療法的若干科學(xué)問題,比如針灸的分子作用網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)制,以及關(guān)鍵的調(diào)控靶標(biāo)還不清楚,有待進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

針灸效應(yīng)是一種生命現(xiàn)象,生命活動(dòng)是建立在蛋白質(zhì)及其相互作用基礎(chǔ)上的信息傳導(dǎo)過程,這個(gè)過程是基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)相互作用的信息反映序列[1]。系統(tǒng)生物學(xué)為研究基因、蛋白、代謝產(chǎn)物之間復(fù)雜的關(guān)系,闡明針灸整體性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了技術(shù)和方法。系統(tǒng)生物學(xué)的主要技術(shù)平臺為組學(xué),包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等,其中基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是較早出現(xiàn)并較為成熟的組學(xué)技術(shù),能有效篩選出針灸效應(yīng)的潛在靶點(diǎn),這為探求針灸效應(yīng)機(jī)制提供了有效信息。例如,國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)利用基因表達(dá)序列分析技術(shù)(serial analysis of gene expression, SAGE)對針刺治療哮喘大鼠的肺組織基因組表達(dá)譜進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)針刺抗哮喘特異性差異表達(dá)基因21個(gè)[2];蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)28種針刺抗哮喘相關(guān)效應(yīng)蛋白[3]。通過對這些調(diào)控基因和蛋白的生物功能和相互作用分析初步闡明了針刺抗哮喘的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并為基于針刺效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的哮喘防治靶標(biāo)研究提供了新的思路[4]。另一方面,大量的基因組序列數(shù)據(jù)證實(shí),DNA上編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域只占人類基因組的極小部分(不足2%)[5-6],其余均是非編碼序列。轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這些非編碼序列是可以表達(dá)的,其表達(dá)產(chǎn)物為非編碼 RNA(non-coding RNA)。越來越多的研究證明非編碼 RNA具有重要的生物學(xué)功能,其中microRNA就是一類發(fā)揮功能性調(diào)節(jié)作用的短鏈非編碼 RNA[7]。將 microRNA引入針灸作用機(jī)制研究領(lǐng)域,可在基因轉(zhuǎn)錄及其他層面更系統(tǒng)深刻地揭示針灸作用的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文就microRNA及其靶基因分析在針灸作用機(jī)制研究中的應(yīng)用和進(jìn)展進(jìn)行綜述,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 MicroRNA的產(chǎn)生及生物學(xué)特性

MicroRNA是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小分子 RNA,廣泛存在于除真菌和海洋植物以外的所有真核細(xì)胞中[8]。MicroRNA起初在胞質(zhì)中由RNA聚合酶Ⅱ的作用下從 DNA轉(zhuǎn)錄一個(gè)原始的內(nèi)源性初級microRNA(Pri-miRNA),Pri-miRNA在核內(nèi)被核酸酶Drosha和輔助因子Pasha加工處理成70個(gè)核苷酸組成的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體microRNA(Pre-miRNA)[9];在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5的作用下Pre-miRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì),再由另一種核酸酶Dicer將其剪切成19～25個(gè)核苷酸的雙鏈成熟microRNA,成熟雙鏈microRNA的一條鏈與Argonaute蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC),RISC特異性識別特定mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated regions, 3’UTR)并與之不完全互補(bǔ)配對,從而抑制翻譯或直接降解靶mRNA的表達(dá),廣泛參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理及病理過程。

隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)microRNA具有以下生物學(xué)特性,microRNA不僅在其自身進(jìn)化上具有高度的保守性,在不同物種間靶位點(diǎn)也具有保守性;另外,microRNA-mRNA構(gòu)成的雙鏈具有熱穩(wěn)定性;MicroRNA沉默靶基因的形式由microRNA與其靶基因的互補(bǔ)程度決定,如果完全互補(bǔ)配對則使靶 mRNA被降解(在植物中比較常見),如果不完全互補(bǔ)則在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制靶基因表達(dá)(常見于哺乳動(dòng)物);最近研究發(fā)現(xiàn),microRNA的作用位點(diǎn)可能是 3’UTR之外的其他位點(diǎn),例如5’UTR、啟動(dòng)子區(qū)或者是 mRNA的編碼區(qū);每個(gè)microRNA可以有多個(gè)靶基因,而不同的microRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因。基于以上多種方式的調(diào)控作用microRNA構(gòu)建了一個(gè)由點(diǎn)到網(wǎng)狀的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),既可以通過一個(gè)microRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá),也可以通過幾個(gè) microRNA的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá),microRNA的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控特點(diǎn)與針灸多途徑、多靶點(diǎn)、多水平、多層次等調(diào)節(jié)作用特點(diǎn)高度契合。目前越來越多的研究從 microRNA及其調(diào)控靶基因的角度探索針灸治療疾病的效應(yīng)機(jī)制,并取得了豐富的研究成果。

2 MicroRNA在針灸機(jī)制研究中的應(yīng)用

2.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究

MicroRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富,參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育,同時(shí)也參與神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的發(fā)生發(fā)展,如腦缺血性再灌注引起的中風(fēng)后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、損傷等疾病[10]。研究表明大鼠動(dòng)脈閉塞引起的腦缺血能夠改變多種microRNA的表達(dá),它們參與調(diào)控一些神經(jīng)元保護(hù)受體功能及炎癥細(xì)胞因子,可以調(diào)節(jié)腦卒中的病理生理學(xué)過程[11]。研究發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)、風(fēng)府、大椎穴預(yù)處理后,腦缺血再灌注模型大鼠局灶性腦梗死后大腦皮質(zhì)miR-290、miR-494表達(dá)量顯著降低,水通道蛋白-4(Aquaporin-4, AQP4)表達(dá)明顯升高,提示通督調(diào)神針灸預(yù)處理可能通過提高 miR-290、miR-494表達(dá)降低AQP4相對表達(dá)量,誘導(dǎo)腦缺血耐受,減輕腦水腫而預(yù)防腦梗死引起的腦損傷[12]。電針刺激天門、百會(huì)、大椎穴能有效降低腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分和腦水含量,并通過調(diào)控 miR-664來降低MMP9相對表達(dá)量,增強(qiáng)腦缺血耐受減輕腦水腫,這可能是針灸預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制之一[13]。另外,針刺大鼠百會(huì)、足三里能下調(diào)腦缺血大鼠腦組織及血清miR-29、上調(diào)miR-320表達(dá),減輕大鼠缺血再灌注后腦損傷[14],針刺后還可下調(diào)腦缺血再灌注腦損傷大鼠外周血miR-126和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達(dá)促進(jìn)腦缺血性腦損傷后血管再生,有助于腦組織損傷后再修復(fù)[15]。在另一項(xiàng)研究中,電針能夠調(diào)節(jié)miR-134表達(dá),miR-134通過調(diào)控LIM激酶(LIM kianse 1, LIMK1)參與電針改善缺血性腦卒中恢復(fù)階段海馬突觸的可塑性,在腦卒中恢復(fù)階段是促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的重要因素之一[16]。

電針曲池和足三里治療大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠,能夠緩解神經(jīng)功能缺損癥狀并減少大腦梗死面積,且電針后梗死灶周圍大腦皮層組織中 miR-9的表達(dá)升高,NF-κB 信號通路相關(guān)的因子(NF-κB p65、TNF-α、IL-11β等)表達(dá)水平下調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)給予 miR-9抑制劑,電針對大腦炎癥的緩解效應(yīng)及對 NF-κB信號通路下游的信號分子的抑制作用顯著降低,但 miR-9抑制劑對NF-κB信號通路上游信號分子水平無明顯影響,提示電針可能通過 miR-9調(diào)控的 NF-κB信號通路下游信號分子發(fā)揮大腦皮層保護(hù)作用[17-18]。電針治療中風(fēng)調(diào)節(jié)相關(guān)microRNA和蛋白對軸突再生有益,在電針對腦缺血性中風(fēng)的靶向研究中發(fā)現(xiàn)電針治療 28 d內(nèi)免疫球蛋白樣受體B(Paired immunoglobulin-like receptor, PirB)mRNA表達(dá)減少,促進(jìn)了損傷后的神經(jīng)突觸的生長,另外用熒光素酶報(bào)告分析證實(shí) miR-181b可直接靶向 PirB mRNA以調(diào)節(jié) PirB、RhoA和 GAP43的表達(dá)來改善神經(jīng)功能,促進(jìn)損傷的修復(fù),說明電針通過調(diào)節(jié)miR-181b調(diào)控靶基因PirB發(fā)揮修復(fù)神經(jīng)損傷效應(yīng),這可能是電針治療中風(fēng)促進(jìn)康復(fù)的一種新機(jī)制[19]。在針灸治療腦缺血再灌注損傷的效應(yīng)機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)、足三里可上調(diào) miR-124、下調(diào)整合素β1蛋白的表達(dá),這些變化可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[20]。

電針已被證明有助于神經(jīng)功能和脊髓損傷(SCI)的恢復(fù),可促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)并具有抗細(xì)胞凋亡作用,有研究發(fā)現(xiàn)電針治療調(diào)控了 SCI大鼠的脊髓組織中 43種 microRNA表達(dá),其中通過下調(diào) miR-181a調(diào)控MAPK磷酸酶-5(MKP-5)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用,電針的神經(jīng)保護(hù)作用部分是通過調(diào)節(jié) SCI大鼠的miR-181a抑制p38 MAPK活化來調(diào)節(jié)的[21]。在另一項(xiàng)針對SCI的研究中,電針處理miR-214表達(dá)顯著上調(diào),進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和疼痛相關(guān)蛋白Nav1.3是miR-214體外和體內(nèi)的兩個(gè)功能靶點(diǎn),電針治療后miR-214表達(dá)上調(diào)抑制了SCI誘導(dǎo)的Nav1.3和Bax的表達(dá)從而降低了神經(jīng)功能和脊髓的損傷程度,這表明miR-214在電針治療SCI功能中發(fā)揮了重要的靶點(diǎn)效應(yīng)[22]。在電針治療SCI的機(jī)制研究中,研究者對T10段脊髓損傷大鼠模型進(jìn)行電針干預(yù),發(fā)現(xiàn)治療后 T10段脊髓中miR-449a的表達(dá)顯著降低。與模型組相比,電針同時(shí)顯著降低了caspase3、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平和 Bax/Bcl-2比值(P＜0.01),而明顯上調(diào) Nestin、NeuN和CGRP表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01),熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示miR-449a與CGRP的3'UTR結(jié)合,從而調(diào)控 CGRP的表達(dá),研究結(jié)果表明電針通過下調(diào) miR-449a表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的存活,加快了脊髓損傷的恢復(fù)[23]。

2.2 消化系統(tǒng)疾病中的研究

針灸作為一種傳統(tǒng)療法治療消化系統(tǒng)中胃腸疾病療效早已得到臨床證實(shí)[24-25],在機(jī)制方面的研究也提示針灸治療是多水平、多靶點(diǎn)的。利用針灸治療術(shù)后腸梗阻(postoperative ileus, POI)的研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸切除術(shù)和結(jié)腸吻合術(shù)后小鼠模型中檢測出 IL-6和miR-19a在Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal, ICC)中的表達(dá)量增加,ICCs中KIT和ano1在小鼠結(jié)腸切口周圍表達(dá)下降。針刺治療可顯著降低炎癥細(xì)胞因子IL-6水平以及miR-19a的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞的活化,同時(shí)促進(jìn)ICCs中KIT和ano1的恢復(fù)。在結(jié)直腸切除術(shù)后患者血清中高表達(dá)的miR-19a也可通過針灸干預(yù)使其表達(dá)量降低從而抑制炎癥反應(yīng)[26]。慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)模型大鼠針刺中脘、足三里、脾俞穴治療后胃黏膜損傷的修復(fù)程度明顯優(yōu)于對照組和模型組,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示 CAG大鼠胃組織中NF-κBp65、miR-155、miR-21上調(diào),miR-146a的表達(dá)下調(diào),并且CAG大鼠中miR-146a和 miR-155/miR-21之間呈負(fù)相關(guān)。針刺治療后 NF-κBp65、miR-155和 miR-21的表達(dá)下調(diào),miR-146a表達(dá)上調(diào),說明 NF-κBp65、miR-155、miR-21 和 miR-146a可能在針刺治療CAG的過程中發(fā)揮重要作用[27]。

2.3 免疫系統(tǒng)疾病中的研究

研究證實(shí) microRNA對免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育分化[28-29]、炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[30]有重要調(diào)節(jié)作用。電針足三里治療 2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)誘導(dǎo)的接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)大鼠模型后,獲得治療組和模型組大鼠腹膜肥大細(xì)胞(rat peritoneal mast cell, RPMC)并在 IL-33刺激下培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比電針治療組的ACD大鼠RPMCs在IL-33刺激后,IL-6、TNF-α、IL-13和 MCP-1表達(dá)量顯著下調(diào),并降低了 RPMCs中miR-155的表達(dá),同時(shí)抑制了NF-κB和AP-1活化;進(jìn)一步將miR-155模擬物轉(zhuǎn)染到RPMCs中使其過表達(dá),與未轉(zhuǎn)染miR-155的RPMCs相比炎癥細(xì)胞因子明顯增加,表明電針對DNFB誘導(dǎo)的ACD大鼠可通過調(diào)控miR-155表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[31]。大量的研究發(fā)現(xiàn)針灸對免疫系統(tǒng)疾病具有顯著的調(diào)節(jié)作用,但是microRNA在針灸調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)效應(yīng)機(jī)制中的研究還很欠缺,需要進(jìn)一步加大研究力度。

2.4 循環(huán)系統(tǒng)疾病中的研究

有研究者運(yùn)用基因芯片技術(shù)研究電針內(nèi)關(guān)穴對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)電針治療可逆轉(zhuǎn)模型中的基因差異表達(dá),其中多個(gè)基因參與了氧化應(yīng)激、心肌收縮、血管平滑肌收縮、肥大細(xì)胞受體、NOD樣受體等生物學(xué)途徑,這提示了針刺調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與了循環(huán)系統(tǒng)的生物學(xué)調(diào)控效應(yīng)[32]。研究發(fā)現(xiàn)電針刺激穴位配伍組(關(guān)元、足三里)可以有效預(yù)防和治療心肌缺血,治療后血清中肌酸激酶-MB(CK-MB)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)和內(nèi)皮素-1(ET-1)均顯著升高(均P＜0.01),細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(均P＜0.01)。和其他組別相比,穴位配伍組顯著上調(diào)了 miR-133并且抑制了miR-208、miR-1和miR-499的表達(dá),其保護(hù)心肌的作用可能與增加 miR-133和抑制 miR-208、miR-1和 miR-499表達(dá)的雙重調(diào)節(jié)有關(guān)[33]。研究發(fā)現(xiàn)許多microRNA和蛋白質(zhì)參與了針刺對高血壓大鼠療效反應(yīng),針刺后miR-339和Sirtuin2(Sirt2)的表達(dá)發(fā)生變化[34-35],在人類 SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá) miR-339則Sirt2表達(dá)下調(diào),而敲低miR-339后人SH-SY5Y細(xì)胞和大鼠PC12細(xì)胞中Sirt2的表達(dá)上調(diào);另外miR-339過表達(dá)增加了SHSY5Y細(xì)胞中NF-κB和FOXO1的乙?；?進(jìn)而推測針刺可能通過表觀遺傳修飾和隨后對其靶標(biāo)(如 miR-339/Sirt2/NF-κB/FOXO1 軸)調(diào)控發(fā)揮效應(yīng)[36]。針刺太沖穴治療自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)后髓質(zhì)的microRNA表達(dá)發(fā)生變化,針刺組與 SHR模型組相比差異表達(dá)的microRNA有23種。與正常對照大鼠相比SHR模型中miR-339、miR-223和miR-145在腦髓質(zhì)中表達(dá)下調(diào),在針刺太沖穴后SHR中miR-339、miR-223和miR-145上調(diào)至基線水平,表明針刺太沖穴治療的SHRs可調(diào)節(jié)microRNA的變化參與調(diào)控大鼠血壓反應(yīng)[34]。

2.5 運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病中的研究

針刺可以治療慢性肌損傷、膝關(guān)節(jié)炎等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。有研究發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里穴可以促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化,改善 MCAO大鼠受損的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能[37-38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里穴可通過激活miR-146抑制Notch1的表達(dá),促進(jìn)缺血側(cè)成熟神經(jīng)元分化,從而改善腦缺血性再灌注損傷后神經(jīng)元功能,促進(jìn)腦卒中后肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[39]。低頻電刺激(low-frequency electrical stimulation,LFES)預(yù)防肌肉萎縮的效應(yīng)和機(jī)制研究中,對5/6腎切除小鼠(CKD小鼠)進(jìn)行15 d的LFES治療,發(fā)現(xiàn)LFES可以防止CKD小鼠比目魚肌和指長伸肌的重量減少和后肢肌肉抓力的喪失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) miR-1和miR-206的表達(dá)在LEFS后的急性反應(yīng)期明顯降低,而miR-1和miR-206可靶向抑制IGF-1蛋白的翻譯表達(dá),說明LFES可能通過抑制miR-1和miR-206表達(dá)激活I(lǐng)GF-1信號通路,促進(jìn)蛋白合成、肌生成以及肌肉蛋白代謝,改善CKD誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮[40]。

2.6 其他疾病

蒙醫(yī)溫針灸治療失眠的研究中發(fā)現(xiàn),接受溫針灸治療(百會(huì)穴、大椎穴、心俞穴)的大鼠與正常大鼠相比有 141個(gè)差異表達(dá)的 microRNA,其中針灸后 miR-101a表達(dá)明顯上調(diào),轉(zhuǎn)染miR-101a模擬物后大鼠海馬細(xì)胞中miR-101a的表達(dá)水平升高,而大鼠神經(jīng)元細(xì)胞中PAX8蛋白的表達(dá)受到明顯抑制,同時(shí)下丘腦、海馬和前額葉皮質(zhì)中IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平顯著降低,說明溫針灸治療的失眠大鼠與上調(diào) miR-101a水平進(jìn)而抑制PAX8的表達(dá)直接相關(guān)[41]。在研究抑郁癥(chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠在電針干預(yù)下microRNA的表達(dá)變化中發(fā)現(xiàn),電針不僅顯著改善了CUMS大鼠的交配數(shù)量、蔗糖偏好、體重等行為學(xué)指標(biāo),而且芯片分析顯示 CUMS大鼠中高表達(dá)的miR-383-5p和miR-764-5p在電針干預(yù)后表達(dá)下降,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-383-5p和miR-764-5p靶基因相關(guān)的20個(gè)信號通路和21個(gè)GO功能和抑郁癥相關(guān),miR-383-5p和miR-764-5p的變化表明電針可能通過調(diào)控相關(guān) microRNA促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子和抑郁神經(jīng)元的異常凋亡,作用于其相關(guān)通路來發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)[42]。最新的研究表明電針可能通過下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)緩解術(shù)后下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的功能亢進(jìn),該研究利用生物信息學(xué)分析證實(shí)microRNAs對CRH具有靶向調(diào)控作用,并在初級下丘腦神經(jīng)元中篩選鑒定出miR-142和miR-376c在mRNA和蛋白水平上抑制 CRH,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)它們與CRH的3’UTR結(jié)合。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在肝切除術(shù)大鼠中,下丘腦miR-142表達(dá)降低,電針干預(yù)后,miR-142和miR-376c表達(dá)升高。重要的是,電針對肝切除術(shù)大鼠HPA軸調(diào)節(jié)功能的改善作用被miR-142拮抗劑阻斷,證明電針可以上調(diào)下丘腦 miR-142的表達(dá),降低CRH水平,以減輕肝切除術(shù)引起的HPA軸過度激活[43]。

3 討論

針灸刺激對機(jī)體生理、病理過程的影響存在多系統(tǒng)、多臟器、多靶點(diǎn)的整體綜合性作用特點(diǎn),在體內(nèi)引起的反應(yīng)包括調(diào)節(jié)基因、蛋白、代謝等多個(gè)層面。系統(tǒng)生物學(xué)為研究分子、細(xì)胞、器官和個(gè)體等各水平間的復(fù)雜相互作用提供了技術(shù)手段,使針灸作用機(jī)制研究從單個(gè)或幾個(gè)分子基因或蛋白的研究模式,轉(zhuǎn)向分析“組學(xué)”變化的整體水平研究模式,加速了對針灸效應(yīng)這一復(fù)雜生命現(xiàn)象的理解。諸多研究表明microRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)影響相關(guān)信號通路,在不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用,是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的一員,也是一類很有前景的新的生物學(xué)標(biāo)志物。MicroRNA在針灸研究中的應(yīng)用為解釋針灸刺激與機(jī)體基因、蛋白組學(xué)的變化之間架起一座橋梁,這在針灸效應(yīng)機(jī)制的研究中具有重要的價(jià)值。近年來,國內(nèi)外學(xué)者主要對針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的microRNA調(diào)節(jié)機(jī)制開展了大量研究工作,同時(shí)也對針灸治療失眠、高血壓、接觸性皮炎等疾病 microRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)針灸能夠調(diào)控多個(gè) microRNA的表達(dá)水平,并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測相關(guān)靶基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。MiR-124、miR -101a、miR -339、miR-214等若干與針灸作用相關(guān) microRNA及其靶向基因的逐步發(fā)現(xiàn),為疾病的治療提供了新的可能干預(yù)靶標(biāo),也為基于針灸效應(yīng)機(jī)制研究創(chuàng)新疾病防治策略提供了新的思路。

盡管近年來已初步明確了一些針灸效應(yīng)的microRNA作用機(jī)制,但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)microRNA這一研究方法應(yīng)用于針灸基礎(chǔ)研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)和拓展。基于針灸的一些基礎(chǔ)科學(xué)問題,比如經(jīng)穴特異性、穴位敏化研究、艾灸產(chǎn)生作用的機(jī)制和規(guī)律,以及一些針灸臨床優(yōu)勢病種比如鎮(zhèn)痛、過敏性疾病中通過microRNA表達(dá)調(diào)控的研究等,從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面進(jìn)一步認(rèn)識針灸的作用規(guī)律和物質(zhì)基礎(chǔ)尤為必要。另一方面,在發(fā)現(xiàn)新的針灸調(diào)控 microRNA的基礎(chǔ)上還要結(jié)合基因表達(dá)譜分析深入開展microRNA與靶基因表達(dá)相關(guān)性、功能恢復(fù)實(shí)驗(yàn)研究等,明確針灸作用的分子機(jī)制。MicroRNA研究技術(shù)和方法也在不斷發(fā)展和完善,基于 microRNA的信息尋找 lncRNA及 mRNA對應(yīng)的關(guān)系,構(gòu)建 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò);MicroRNA靶向負(fù)調(diào)控基因之外的非經(jīng)典分子途徑研究;對多條microRNA共同調(diào)控靶基因和信號通路,或以microRNA簇為單位的研究;MicroRNA的甲基化及microRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和定位分析等為microRNA研究提供了新的切入點(diǎn)。將上述新的microRNA研究方法和策略應(yīng)用于針灸機(jī)制研究將從全新的角度解釋針灸刺激如何構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),有助于從更深層面上挖掘針灸效應(yīng)調(diào)控機(jī)制并發(fā)現(xiàn)治療新靶點(diǎn)。