蜜蜂腸道微生物研究概況

黃祚驊，范季堯，吳珍紅

(1.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)院，福建 福州 350017；2.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350017)

約35億年前微生物這一古老的生命就出現(xiàn)在地球上每個(gè)角落，與地球各種生態(tài)位緊密結(jié)合，參與地球養(yǎng)分循環(huán)，與人、動(dòng)物和植物健康和疾病息息相關(guān)[1]。但目前99%的微生物尚未被發(fā)現(xiàn)與鑒定[2]。微生物成為全球研究的熱點(diǎn)，美國(guó)、日本、加拿大、中國(guó)等都花費(fèi)巨資設(shè)立微生物組研究計(jì)劃，中國(guó)微生物組計(jì)劃列入了“十三五”優(yōu)先發(fā)展領(lǐng)域。在人類生活中，蜜蜂能產(chǎn)生極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，它是存在于大自然中最重要的傳粉昆蟲類，它一方面可以提供寶貴的蜂產(chǎn)品，另一方面它對(duì)探究植物的多種形態(tài)和如何平衡自然界生態(tài)起著舉足若輕的作用[3]。但相比于人和動(dòng)物，蜂腸道菌群的研究較少。本綜述主要從蜜蜂主要共生菌類群、共生菌在不同生境的腸道菌群分布、健康蜜蜂腸道中的病原微生物3個(gè)方面對(duì)近年來蜜蜂腸道菌群的研究進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)目前研究的一些問題進(jìn)行了討論。

1 蜜蜂主要共生菌類群

1.1 蜜蜂核心菌群

蜜蜂體內(nèi)含有大量的微生物，如成蜂體內(nèi)含有約109個(gè)細(xì)菌[4]，目前這些細(xì)菌的共生菌不但使蜜蜂對(duì)病蟲災(zāi)害的抵抗性得以增強(qiáng)，同時(shí)增加了花粉物質(zhì)被宿主消化吸收的能力，降低有毒物質(zhì)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，甚至于蜜蜂種群的繁殖也被影響[5-8]。Cox-Foster等首次將美國(guó)、非洲、瑞士和德國(guó)等不同地區(qū)的同一種群的蜜蜂(Apismellifera)通過宏基因組進(jìn)行比較分析，通過分析結(jié)果可以可以發(fā)現(xiàn)，其腸道內(nèi)生菌的組成成分高度一致[9]。Gilliam他們?yōu)榱藢⑽鞣椒漕惖哪c道內(nèi)生菌實(shí)行有關(guān)的剖離鑒別，通過測(cè)序結(jié)果我們可以知道西方蜜蜂的腸道微生物中有1%是酵母類微生物；29%為革蘭氏陽性菌；革蘭氏陰性菌，也有可能是可以更變的革蘭氏細(xì)菌所承的占比為70%[10]。與此同時(shí)，Rada等人對(duì)蜜蜂的中腸和直腸的微生物也進(jìn)行了研究鑒定，通過研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)蜜蜂腸道內(nèi)的菌落組成主要有厭氧、好氧菌、葡萄球菌、芽胞桿菌和酵母菌等，而其中好氧微生物的數(shù)量明顯低于厭氧微生物，厭氧微生物的總數(shù)與厭氧革蘭酸桿菌的數(shù)量基本一致[11]。在16S rDNA 序列結(jié)論和宏基因組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)處在不同地方的西方蜜蜂的腸道共生菌進(jìn)行研究，這一研討的成果是發(fā)掘出這些生物體內(nèi)的細(xì)菌可能為以下8種，分別是Gilliamella、Snodgrassella、Gammaproteobacteria、Bartonella、Acetobacteraceae、Bifidobacterium、Lactobacillus、Lactobacillusacidophilus[9，12-14]。

以上可知，因分類采用的研究方法不同造成分類名稱的差異，有待于規(guī)范。雖然在生活環(huán)境、地理位置和蜂類種群的影響，但細(xì)菌的腸道共生菌卻未因此受到太大的影響，屬高度保守的狀態(tài)[12]。Martinson等人發(fā)現(xiàn)蜜蜂腸道中的內(nèi)生菌中其它細(xì)菌與核心菌相比數(shù)量稀少并且呈現(xiàn)不穩(wěn)定性分布，不過我們可以確定蜜蜂的腸道中有嚴(yán)格的生態(tài)位。熊蜂以及蜜蜂屬的其他種類蜂都具有與西方蜜蜂相同的核心菌群[15]。在蜂群中，蜜蜂腸道的共生菌的菌落與菌種之間的交流緊密相連，因而在一定程度上也提高了蜂腸內(nèi)共生細(xì)菌與蜜蜂的進(jìn)化能力。在對(duì)處于不同地方的蜜蜂進(jìn)行分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)并沒有很強(qiáng)的相關(guān)性，那么蜜蜂腸道中的共生菌不存在地域差別的原因可能與蜜蜂在不同季節(jié)會(huì)到各地進(jìn)行授粉導(dǎo)致不同地域的蜜蜂之間不存在長(zhǎng)時(shí)間地理隔離的原因。

1.2 不同蜜蜂菌群差異以及蜜蜂真菌分離

美國(guó)耶魯大學(xué)的Moran分別在兩個(gè)不同的地方各4種不一樣的蜜蜂群落里收集了40只蜜蜂，通過454測(cè)序平臺(tái)對(duì)蜜蜂腸道共生菌進(jìn)行16 S rDNA V6-V8可變區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行深度測(cè)序研究，對(duì)意大利蜜蜂腸道內(nèi)生菌與地域、種群之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，以此來探討蜜蜂共生群的差異性[16]。Gilliam等人對(duì)生長(zhǎng)在意大利的工蜂腸道共生菌進(jìn)行分離鑒定，其結(jié)果顯示了Enterobactercloacae、Escherichiacoli、Enterobaceraerogenes、shigelta、Klebsiella等5種菌株，并未從蜂類的腸道中分離出假單胞菌和歐文氏菌屬，同時(shí)也分離出了Alternariatenuissima、Cladosporiumcladosporioides、Bipolaris、Curvularia、Penicilliumochrochloron、Penicilliumurticae和Rhizopusarrizus這7種真菌，并且還分離出7種酵母菌，其中Torulopsismagnoliae、Candidaparapsilosis、Torulopsissp．分離率最高[17]。蜜蜂腸道共生菌會(huì)缺失一部分的核心菌種，并獲得的某些新菌種，這一過程受到宿主的進(jìn)化的影響。比如大蜜蜂(Apisdorsata)的腸道中并沒有Snodgrassella的存在，但是在蜜蜂屬中，全部的蜂種都是擁有新的Bartonella、Frischella屬細(xì)菌，而在熊蜂屬及無刺蜂腸道中并沒有發(fā)現(xiàn)，表明了這是在蜜蜂書蛻變進(jìn)化中所獲得的這一分支。

2 共生菌在不同生境的腸道菌群分布

2.1 不同蜂齡的腸道菌群分布有差異

蜜蜂腸道共生菌也受蜜蜂蜂齡的影響。將中華蜜蜂的發(fā)育階段采用16S rDNA V6-V8更正變化區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE分析。其中對(duì)封蓋一日齡蛹、破巢幼蜂和采集蜂這3個(gè)齡期分別開始著重研究，結(jié)果表明采集蜂腸道內(nèi)的微生物種類最豐富，而其它2個(gè)齡期的腸道微生物很相似，通過對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)序，獲得了Gilliamella、Snodgrassella、Carnobacterium、Nesseriaceae、Frischella、Janthinobacterium、Pseudomonas、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc10種菌屬。他們當(dāng)中的封蓋一日齡蛹和破巢幼蜂的主要菌屬為SnodgrasseUa和Pseudomonas；采集蜂的主要菌屬為Giuiamella和Snodgrassella。Moran對(duì)意大利多個(gè)地方的蜂群進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)成年蜂腸道內(nèi)的共生菌主要為Snosgrassella等菌群[16]。楊志波他們對(duì)夏秋季交替時(shí)候的意大利工蜂腸道中分別鑒別出Bacillus、Proteus、Citrobacter、泛生菌屬Pantoea、Enterobacter、Klebsiella和假單胞菌屬Pseudomonas[18]?？梢赃\(yùn)用qPCR和454滲透測(cè)序的方式對(duì)蜂種所有的發(fā)育階段(幼蟲，新出房的蜜蜂以及成年蜜蜂)的不同時(shí)問段的蜜蜂腸道共生菌的分布情況和定值程度進(jìn)行研究是Martinson等人的成果，這一結(jié)果證明了幼蜂和工蜂腸道內(nèi)繁養(yǎng)的菌類是微少的，不過在有年紀(jì)差異的成年工蜂中，它的腸道內(nèi)生菌的成分也明顯不同[4]。

2.2 蜂道不同部位的腸道菌群分布有差異

腸道微生物也受蜂道位置的影響。利用微傳感器對(duì)蜜蜂腸道的前、中、后3個(gè)位置的酸堿度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示這3個(gè)位置的酸堿度有顯著差異(蜜蜂前腸、中腸、后腸的酸堿度大概為8、10、7)，后腸微生物數(shù)量最多，這是一個(gè)導(dǎo)致腸道微生物分布不均勻的重要因素[19]。Martinson等利用qPCR等方法，對(duì)蜜蜂的腸道的不同位置進(jìn)行了觀察，利用高通量測(cè)序來測(cè)定腸道共生菌的數(shù)量以及它們的分布關(guān)系，證明了蜜蜂腸道微生物受腸道不同位置的影響[4]。蜜蜂后腸具有豐富的腸道微生物，共生菌個(gè)數(shù)大概為109個(gè)，高達(dá)占比屬于細(xì)菌量的99%。蜜蜂擁有回腸和直腸2個(gè)獨(dú)立區(qū)域，每一個(gè)區(qū)域都擁有相應(yīng)的獨(dú)特菌種。蜜蜂的回腸中的兩種革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢(shì)菌種[4，20]。而在蜜蜂的直腸中，革蘭氏陽性菌乳桿菌Lactobacillus、Lactobacillusacidophilus和Bifidobacterium為優(yōu)勢(shì)菌種但是這兩種乳酸菌在回腸的腸腔中被發(fā)現(xiàn)過，不一樣的是只有稀少的含量。蜜蜂的幽門、蜜囊的共生菌的優(yōu)勢(shì)菌種也不一樣，其中蜜蜂幽門處的F.perrara含量豐富，而蜜囊種則是Lactobaeillus菌群占優(yōu)勢(shì)，并且與花蜜和蜂巢中大部分的共生菌的菌種同源性很高。沃爾巴克氏菌(Wolbachia)在全球的散布也是廣泛的。它普遍存在于西方蜂蜜的生殖組織中，并且對(duì)蜜蜂的種群繁育具有重大的影響[10，21]。

2.3 蜂道季節(jié)、抗生素對(duì)腸道菌群分布有影響

蜜蜂的腸道共生菌的數(shù)量和種類受季節(jié)的影響。Rada等人通過對(duì)夏冬季的特定的蜜蜂總?cè)旱哪c道微生物進(jìn)行分離鑒定，確定一些典型的腸道菌群的種類。測(cè)序結(jié)果顯示厭氧和好氧微生物、乳酸桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌、芽胞桿菌和酵母菌是蜜蜂腸道微生物中的常見種群。冬天的蜜蜂腸道中有更多的厭氧微生物和酵母菌，夏天的蜜蜂腸道中則有更多的大腸桿菌和葡萄球菌[11]。

抗生素也是影響蜜蜂腸道共生群種類的一個(gè)重要因素。Gilliam等從388只蜜蜂的腸道中分離出18種真菌，對(duì)部分蜜蜂喂食土霉素和富馬西林等抗生素，使之與原始對(duì)照組進(jìn)行比較來觀察真菌的存在情況。通過觀察真菌變化可知，抗生素對(duì)蜜蜂腸道微生物的成分造成了影響，與原始對(duì)照組相比，喂食抗生素的蜜蜂所含的真菌種類明顯變少[17]?？股乜梢载S富蜜蜂的耐藥基因庫(kù)，有益于宿主的微生物的群落改變，但是長(zhǎng)時(shí)間的喂食單一抗生素很有可能是的蜜蜂蜂群中對(duì)抗生素出現(xiàn)抗藥性。Tian等利用PCR和測(cè)序技術(shù)對(duì)美國(guó)不同地區(qū)的蜜蜂腸道細(xì)菌的抗生素抗性位點(diǎn)進(jìn)行診斷，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期喂食盲目的喂食單一抗生素導(dǎo)致了蜜蜂腸道微生物群產(chǎn)生相應(yīng)的抗性基因，而在不使用抗生素養(yǎng)蜂的地區(qū)，蜜蜂腸道的抗性基因明顯要少很多。由此可以推斷，美國(guó)某些區(qū)域的蜜蜂腸道共生菌的菌群失調(diào)是因?yàn)轲B(yǎng)蜂人使用新抗生素所造成的[22]。

3 健康蜜蜂腸道中的病原微生物

蜜蜂與其腸道內(nèi)的病原微生物也有很大的聯(lián)系，擬幼蟲芽胞桿菌、蜂房球菌、尤瑞斯桿菌、糞鏈球菌、塵埃芽胞桿菌、蜂房哈夫尼菌等病原菌大量的生存在蜜蜂的腸道內(nèi)。其中由擬幼蟲芽胞桿菌和蜂房球菌導(dǎo)致的美歐蜜蜂的致命結(jié)果是蜜蜂幼蟲大幅度腐爛死亡，對(duì)蜜蜂種群的繁衍造成毀滅性的影響，如果不加以控制，這兩種疾病很可能對(duì)蜜蜂種群造成毀滅性的打擊[23-24]，不過這些病原菌在一般情況下保持穩(wěn)定，無法引發(fā)蜜蜂的某些病癥，只會(huì)在特定情況下受部分外界條件的誘發(fā)才有幾率導(dǎo)致該疾病的發(fā)生。最近幾年，如蜂群崩潰癥(colony collapse disorder，CCD )等蜂群類病癥所導(dǎo)致蜜蜂數(shù)量聚減情形，使人類更加專注于蜜蜂健康的研究，同時(shí)也加大了對(duì)蜜蜂腸道中各式各樣微生物腸道的鉆研力度[25]。

4 討論

綜上所述，現(xiàn)在的研究體現(xiàn)出了蜜蜂腸道擁有一個(gè)簡(jiǎn)單的核心菌群。在單個(gè)蜜蜂個(gè)體腸道中，菌株的種類非常豐富。不過根據(jù)時(shí)間的推移，現(xiàn)代更加先進(jìn)的技術(shù)對(duì)腸道菌的研討結(jié)果勢(shì)必與傳統(tǒng)的方式方法帶來的結(jié)果有所不同，這樣的結(jié)果使得社會(huì)對(duì)于共生菌菌屬的說明不統(tǒng)一，在學(xué)術(shù)界關(guān)于腸道共生菌相關(guān)的理論有所沖突；另一方面，共生菌在各個(gè)蜂群種類中穩(wěn)定繁殖與交錯(cuò)更替所產(chǎn)生的變化道理仍是模糊不清的狀態(tài)。怎么樣去處置這樣的問題是未來研究的重要之處。目前人類所掌握的各種技術(shù)不斷在進(jìn)步與發(fā)展，傳統(tǒng)意義上的培養(yǎng)方式已經(jīng)顯得容錯(cuò)率不高，我們可以知道的是，使用16S rRN A分析等分子生物學(xué)方法可以在現(xiàn)階段幫助我們?nèi)パ芯窟@一問題，這種方式是基于高通量測(cè)序的宏基因組分析，在不同種類，不同樣式的蜂間中進(jìn)行比選，以此來推動(dòng)在蜜蜂腸道菌群中不斷發(fā)現(xiàn)，研究其特殊功能與演化歷史、研究共生菌對(duì)蜂群健康、開發(fā)含益生菌制劑的蜂糧、進(jìn)行蜂的生物防治等，這項(xiàng)研究在今后將會(huì)對(duì)中國(guó)蜜蜂的研究及我國(guó)生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、農(nóng)業(yè)等的維護(hù)與發(fā)展產(chǎn)生不可磨滅的重要意義。