沙蟾毒精抗腫瘤作用研究進展

闞鈞，周瑞生，侯雪楠，白莎莎，黃海福，周岱翰，張恩欣

(1 廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510405；2 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院；3 廣州中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院)

中藥來源于天然動植物，中醫(yī)中藥在抗腫瘤應(yīng)用方面顯示出了其獨特的優(yōu)勢，多種中藥提取物制成的中藥制劑如華蟾素注射液、鴉膽子油乳、參芪扶正注射液等在臨床抗腫瘤治療中取得了很好的療效。華蟾素注射液是以中華大蟾蜍的陰干全皮為主要原料，經(jīng)水提醇沉工藝制備而成。蟾蜍這味中藥在臨床腫瘤治療中應(yīng)用已久，其分泌物蟾酥及干燥表皮蟾皮均可入藥。經(jīng)現(xiàn)代中藥學成分分析，蟾酥及干蟾皮的化學成分主要有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、蟾毒色胺類及甾醇類化合物等[1]。沙蟾毒精是蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物中的一種主要活性單體成分，在蟾酥中含量達1.5%～2%，且表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性。有學者[2]對從蟾酥及蟾皮中分離得到的60余種蟾毒內(nèi)酯類化合物進行抗腫瘤作用篩選，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精腫瘤抑制活性最顯著，在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均具有很好的抗腫瘤活性，引起了越來越多國內(nèi)外學者的關(guān)注?，F(xiàn)將沙蟾毒精抗腫瘤作用研究進展綜述如下。

1 沙蟾毒精的發(fā)現(xiàn)、提取及藥代動力學

20世紀80年代，國內(nèi)就有學者[3]發(fā)現(xiàn)蟾酥的某些成分具有抗腫瘤作用，同期也有國外學者對日本蟾蜍及越南蟾蜍進行化學成分研究，直至20世紀90年代國內(nèi)才有關(guān)于中華大蟾蜍化學成分的文獻[4]報道發(fā)表。1993年，日本學者[5]從蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物中分離出一種成分，將其命名為arenobufagin，并就其對心肌細胞鈉-鉀泵ATP酶的抑制作用進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)arenobufagin具有一定的強心作用，對鈉-鉀泵ATP酶抑制效果是烏本苷的3.5倍。此時期國內(nèi)有學者[6]繼續(xù)進行蟾蜍化學成分的分離研究，并得到了更多的單體成分。2007年，國內(nèi)學者[7]進一步分析發(fā)現(xiàn)，arenobufagin即為沙蟾毒精。

近年來，有研究[8]采用特征圖譜法測定不同產(chǎn)地干蟾皮的沙蟾毒精的含量，結(jié)果表明四川產(chǎn)地蟾皮的沙蟾毒精含量較高(大花皮、中黑皮、超大皮、棕褐色皮、小黑皮質(zhì)量分數(shù)分別是0.252 4%、0.158 4%、0.181 1%、0.125 8%、0.108 8%)，其次是江蘇產(chǎn)地的黑皮(0.227 5%)，進一步表明沙蟾毒精在干蟾皮中具有較高的含量。李娟等[9]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定9種蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物，測得沙蟾毒精的含量為0.32～0.83 mg/g，為沙蟾毒精含量的測定提供了思路和方法。陳瀛瀾等[10]發(fā)現(xiàn)，蟾酥鮮漿經(jīng)不同方法(日曬干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓風干燥、80 ℃鼓風干燥、冷凍干燥)炮制加工，其含有沙蟾毒精的含量并未有明顯差異，他們還指出50 ℃和80 ℃鼓風干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更強的腫瘤細胞抑制效果，但未說明產(chǎn)生不同抑制作用的具體成分。李曉龍等[11]進行蟾皮抗癌活性成分的正交分離純化研究，首次發(fā)現(xiàn)了一種簡單高效的3位磺酸化沙蟾毒精的合成和富集方法，并通過該方法對總蟾毒配基進行了磺酸化，實現(xiàn)了大量具有潛在抗癌活性化合物的合成和富集，為進一步實現(xiàn)高效低毒化合物的篩選提供了基礎(chǔ)。韓玲玉等[12]對華蟾素注射液中化學成分進行研究，結(jié)果顯示蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類為華蟾素注射液的主要抗腫瘤活性成分，其中分離得到的化合物中就有沙蟾毒精。陸國弟等[13]將沙蟾毒精與牛血清蛋白進行分子對接研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精能與小牛血清發(fā)生中等強度的結(jié)合，證實白蛋白是沙蟾毒精的載藥蛋白。Feng等[14]進行沙蟾毒精藥代動力學研究，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精的代謝穩(wěn)定性優(yōu)于其他報道的蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類化合物，還觀察到CYP3A5基因?qū)ι丑付揪u基化具有偏好性，為闡明沙蟾毒精的Ⅰ期代謝提供了重要數(shù)據(jù)，有助于臨床前藥物的開發(fā)和合理使用。Yuan等[15]通過基于Mpeg-PLGA的納米膠束系統(tǒng)作為沙蟾毒精的載體進行藥代動力學研究，發(fā)現(xiàn)納米膠束可能通過增加藥物分子的細胞攝取增強了其抗癌作用，為進一步臨床應(yīng)用給藥提供了依據(jù)。

2 沙蟾毒精的抗腫瘤作用

隨著沙蟾毒精化學成分的進一步明確和提取工藝的不斷改進，關(guān)于沙蟾毒精抗腫瘤活性的研究也日漸增多，近年來國內(nèi)外學者紛紛對其抗腫瘤作用表現(xiàn)出了濃厚的興趣。按照沙蟾毒精抗腫瘤作用機理不同大致可以分為三類，一是促進腫瘤細胞凋亡，二是抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，三是抗腫瘤血管生成。

2.1 沙蟾毒精促進腫瘤細胞凋亡 關(guān)于沙蟾毒精抗腫瘤作用的研究最早見于2011年，曹惠慧等[16]的研究表明，沙蟾毒精具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性，其可能通過活性氧自由基(ROS)、細胞內(nèi)鈣離子、MAPK和NF-κB信號通路調(diào)控肝癌細胞凋亡。隨后有學者[17, 18]發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可通過活化DNA修復酶PARP和自噬基因LC-3及下調(diào)mTOR表達，從而抑制HepG2/ADM裸鼠移植瘤的生長，證實沙蟾毒精可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導肝癌細胞凋亡及自噬，從而發(fā)揮抗肝癌作用。黨琳等[19]采用沙蟾毒精處理人肝癌SMMC-7721細胞，處理之后處于G2/M期細胞數(shù)量明顯增加，Bax蛋白表達升高，bcl-2蛋白表達降低，推測沙蟾毒精可能通過線粒體凋亡途徑誘導人肝癌SMMC-7721細胞凋亡。Deng等[20]通過分子模擬等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可能通過ATM/ATR信號通路發(fā)揮細胞周期阻滯作用，從而達到促細胞凋亡效果。Xu等[21]通過構(gòu)建結(jié)腸癌EGFP-SW480細胞裸鼠原位癌模型，觀察到沙蟾毒精可以誘導Bax蛋白介導的細胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細胞的生長，并通過細胞實驗進一步證實沙蟾毒精是通過Bax-PGAM5L-Drp1復合物介導的內(nèi)源性凋亡發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以誘導胰腺癌細胞G2/M周期阻滯，從而促進胰腺癌細胞的凋亡，還可以增強胰腺癌細胞對吉西他濱和5-氟尿嘧啶的敏感性。劉倩等[23]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以促進肺癌PC-9細胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)這一效應(yīng)可能是通過線粒體途徑誘導的。還有研究[24]指出，沙蟾毒精可以引起非小細胞肺癌A549細胞及NCI-H460細胞發(fā)生凋亡，凋亡的發(fā)生可能與Noxa相關(guān)的信號通路激活有關(guān)。Li等[25]采用Hoechst33342熒光染色觀察到，沙蟾毒精作用于非小細胞肺癌A549細胞后，邊集的細胞不斷增加，細胞核高度固縮、凝聚，出現(xiàn)凋亡小體；AnnexinV-PI雙染結(jié)果顯示，沙蟾毒精可以誘導A549細胞的凋亡，且呈劑量依賴性。Deng等[26]對沙蟾毒精誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡進行研究，結(jié)果表明沙蟾毒精在體內(nèi)外都具有良好的抗乳腺癌活性，能夠抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細胞的增殖活力，誘導腫瘤細胞凋亡，其可能發(fā)揮作用的機制是激活JNK通路、調(diào)控YAP磷酸化，最終導致乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。Yue等[27]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡和G2/M周期阻滯。Lv等[28]通過對比沙蟾毒精及蟾毒靈對人食管鱗狀細胞癌的抗癌效力，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精的抗癌作用更強，且對人正常食管鱗狀細胞的毒性較低，表明沙蟾毒精在癌癥和正常細胞之間具有很高的選擇性，其發(fā)揮抗癌效力的機制可能為通過內(nèi)源和外源途徑激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，通過增強caspase磷酸化激活P53信號傳導，促進食管癌細胞凋亡，證明了沙蟾毒精對食管鱗狀細胞癌的P53靶向治療潛力。Han等[29]進行沙蟾毒精對人膠質(zhì)母細胞瘤U-87細胞作用的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精對癌性神經(jīng)膠質(zhì)細胞具有明顯的促凋亡作用，且具有較高的選擇性，其可能通過p38/MAPK信號通路發(fā)揮作用，并在大鼠的腦脊液中發(fā)現(xiàn)了沙蟾毒精，為沙蟾毒精在神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的應(yīng)用提供了依據(jù)。

2.2 沙蟾毒精抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移 目前國內(nèi)外針對沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在其促進腫瘤細胞凋亡方面，對抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的研究相對較少。曹惠慧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以抑制肝癌HepG2細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精可以下調(diào)磷酸化表皮生長因子受體水平，從而發(fā)揮抑制胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精通過下調(diào)β-catenin通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制前列腺癌PC3細胞的侵襲和遷移，為沙蟾毒精作為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療方法提供了依據(jù)。

2.3 沙蟾毒精抑制腫瘤血管生成 腫瘤細胞的生長依賴于周圍血管的支持，抗腫瘤血管生成藥物可以切斷腫瘤細胞生長所需的氧氣及其他營養(yǎng)物質(zhì)，從而實現(xiàn)間接殺傷腫瘤細胞的作用。劉俊珊等[31]研究發(fā)現(xiàn)，沙蟾毒精具有明顯的體內(nèi)外抑制血管生成的作用，推測其抑制作用可能與誘導血管內(nèi)皮細胞周期阻滯及凋亡有關(guān)。隨后有研究[18]進一步指出，沙蟾毒精可以通過抑制VEGFR-2信號通路抑制血管內(nèi)皮生長因子介導的血管生成。

3 沙蟾毒精臨床應(yīng)用需解決的問題

目前沙蟾毒精的抗腫瘤作用研究多集中在促腫瘤細胞凋亡方面，這可能與其具有殺傷腫瘤細胞的特性有關(guān)，但關(guān)于沙蟾毒精是否選擇性殺傷腫瘤細胞的研究卻并不充分，只有少數(shù)研究對比了沙蟾毒精對正常組織細胞的作用，論據(jù)的缺乏限制了沙蟾毒精的進一步臨床應(yīng)用。

沙蟾毒精的毒性作用及不良反應(yīng)也是下一步臨床應(yīng)用需要解決的主要問題。有研究[32,33]表明，沙蟾毒精可能通過結(jié)合鈉-鉀泵ATP酶的α亞基對鈉-鉀泵產(chǎn)生抑制作用。進一步研究[34]表明，該機制可能會導致心肌細胞鈣超載和能量紊亂，臨床表現(xiàn)為超過一定劑量時產(chǎn)生心肌抑制導致傳導阻滯和緩慢心律失常。如何控制沙蟾毒精應(yīng)用劑量和減毒也是下一步研究的重點。Hou等[35,36]通過將抗腫瘤劑與ROS清除劑聯(lián)合使用的策略，合成了6種沙蟾毒精的新型雜交品種，評價了它們對人肝癌細胞系HepG2細胞、阿霉素耐藥亞系HepG2/ADM細胞和人心肌細胞系A(chǔ)C16細胞的體外細胞毒性，結(jié)果表明雜交品種對人心肌細胞系A(chǔ)C16細胞的細胞毒性有所減弱，為降低沙蟾毒精的心臟毒性提供了新的應(yīng)用策略。

綜上所述，沙蟾毒精這一中華大蟾蜍中提取的有效單體成分，其抗腫瘤作用已經(jīng)得到了廣泛關(guān)注，沙蟾毒精可通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。但是將其應(yīng)用于臨床，還有很長的路要走，進行其抗腫瘤機制的更深入研究、解決其給藥劑量和降低毒副反應(yīng)是未來研究的方向。