口蹄疫幾種新型疫苗的研究進(jìn)展

劉萍董金杰（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司甘肅蘭州730046）

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口蹄疫幾種新型疫苗的研究進(jìn)展

劉萍 董金杰*（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司 甘肅 蘭州 730046）

本文就幾種有發(fā)展前途的新型口蹄疫疫苗的研究情況進(jìn)行了綜述。

1 口蹄疫新型疫苗研發(fā)的必要性

（1）口蹄疫滅活疫苗自誕生以來使用70多年，實踐證明滅活疫苗可以有效地限制口蹄疫的流行范圍。與嚴(yán)格的政府防控結(jié)合時，甚至可以根除地方性口蹄疫?？谔阋咴趤喼蕖⒎侵?、歐洲及美洲的許多國家都有發(fā)生，經(jīng)過20世紀(jì)后半葉有效的疫苗預(yù)防接種，歐洲大多數(shù)國家和美洲部分國家都消滅了口蹄疫。目前除歐盟取消了口蹄疫滅活疫苗免疫接種政策外，南美和亞洲多數(shù)國家仍然在使用口蹄疫滅活疫苗預(yù)防和控制口蹄疫。（2）相比新型疫苗，口蹄疫滅活疫苗存在免疫效果良好、生產(chǎn)工藝成熟等諸多優(yōu)點。但是隨著實踐經(jīng)驗和研究的深入，口蹄疫滅活疫苗的缺點也逐漸被人熟知。①滅活疫苗使用以來，對滅活疫苗的未徹底滅活，造成口蹄疫的暴發(fā)；②口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)過程中存在病毒繁殖，以及對實驗動物疫苗免疫后的抗病毒攻擊試驗，這些環(huán)節(jié)稍有不慎就有可能使病毒擴(kuò)散從而造成口蹄疫的流行；③口蹄疫病毒基因組非常容易變異，一旦發(fā)生變異，使用原來流行毒株制備的疫苗對變異株的保護(hù)能力就會下降。基于上述原因，研究新型疫苗勢在必行?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為新型疫苗的研發(fā)提供了思路，目前正在研發(fā)的新型疫苗有多。

2 幾種比較有潛力的新型疫苗的研究及應(yīng)用情況

2.1 基因工程亞單位疫苗 （1）基因工程亞單位疫苗是指使用基因工程技術(shù)將編碼病原微生物抗原表位導(dǎo)入受體菌或者細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)抗原，然后制備的一類疫苗。Kleid等將口蹄疫抗原基因?qū)氪竽c桿菌成功表達(dá)VP1融合蛋白抗原，并用此抗原制備了口蹄疫基因工程亞單位疫苗，在牛和豬體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，從此各國科學(xué)家開始廣泛使用這種技術(shù)研發(fā)口蹄疫疫苗。（2）1979年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)A型口蹄疫病毒空衣殼在豚鼠體內(nèi)的免疫原性與完整病毒粒子相同，而抗空衣殼血清與抗病毒血清也具有相同的特異性，由此開始了空衣殼的亞單位疫苗研究。近幾年，隨著真核表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展，口蹄疫先后用酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)都得到較好的應(yīng)用，另外，也有一些轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)口蹄疫病毒蛋白的報道。

2.2 合成肽疫苗 合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白質(zhì)序列為依據(jù)，用人工方法合成多肽并連到大分子載體上作為抗原，加入佐劑制備的一類疫苗。20世紀(jì)60、70年代，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒最重要的抗原決定簇位于VP1上。20世紀(jì)80年代，學(xué)者們開始嘗試使用VP1蛋白作為抗原研制疫苗，試驗證明VP1蛋白免疫具有一定效果，但還不足以保護(hù)動物受口蹄疫強(qiáng)毒攻擊。隨著核酸測序技術(shù)和化學(xué)合成肽技術(shù)的發(fā)展，人們逐步發(fā)現(xiàn)VP1上的多個重要的抗原位點，于是用化學(xué)方法合成了這些抗原位點氨基酸序列，并做了動物實驗，發(fā)現(xiàn)140~160肽能刺激豚鼠產(chǎn)生高水平中和抗體，并能保護(hù)強(qiáng)毒攻擊。近些年來，國內(nèi)在口蹄疫合成肽疫苗的研究方面取得了很大成績，2006年，復(fù)旦大學(xué)聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所等4家單位共同研制的“抗豬O型口蹄疫基因工程疫苗”獲得成功，并獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的“一類新獸藥證書”。中牧實業(yè)股份有限公司與上海申聯(lián)生物醫(yī)藥公司共同研發(fā)了一種將口蹄疫病毒抗原與豬IgG重鏈恒定區(qū)連接，并在大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白作為抗原的豬口蹄疫，免疫效果較好。隨著使用范圍的擴(kuò)大，人們對合成肽疫苗的重視程度將會增加。

2.3 表位疫苗 抗原表位又叫抗原決定簇，是抗原分子中能夠與T細(xì)胞表面受體(TCR)、B細(xì)胞表面受體(BCR)或抗體分子的抗原結(jié)合片段(Fab)發(fā)生特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。表位疫苗是利用基因工程方法體外表達(dá)或者人工合成病原微生物的抗原表位。Bittle等合成了口蹄疫病毒O1K株VP1上的7個短肽，將其分別與KLH蛋白偶聯(lián)后免疫兔子和豚鼠，結(jié)果VP1蛋白141~160及200~213位的短肽引起機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，口蹄疫表位肽疫苗的研究拉開序幕。Zamorano等將口蹄疫VP1蛋白135~144、135~160短肽制成多聚體，免疫動物均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高的抗體。常惠蕓、邵軍軍等利用基因技術(shù)、蛋白表達(dá)等相關(guān)技術(shù)研制了針對豬、牛和羊的口蹄疫病毒多表位重組疫苗，該疫苗無論在試驗動物還是本動物，不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的中和抗體，還能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，具有良好的免疫效果。曹軼梅、盧曾軍等用3個不同譜系O型口蹄疫病毒B細(xì)胞表位和通用型細(xì)胞表位串聯(lián)表達(dá)，加入聚肌胞佐劑，使免疫豬的強(qiáng)毒攻擊保護(hù)率明顯得到提高。

2.4 核酸疫苗 核酸疫苗也稱基因疫苗，是把外源的抗原基因克隆到質(zhì)粒上，然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，是外源基因在動物內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生蛋白抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的疫苗。從理論上講，核酸疫苗成本低，免疫期長，又易于設(shè)計和構(gòu)建，因此被稱為免疫學(xué)上的第三次革命。最初構(gòu)建的口蹄疫核酸疫苗包含A12株cDNA全基因組的pWRM質(zhì)粒，但全基因組在表達(dá)時有可能會產(chǎn)生活病毒，因此在之后的研究中通常只構(gòu)建表達(dá)抗原表位的核酸疫苗，而最常用表達(dá)的抗原表位仍舊是衣殼蛋白基因P1和非結(jié)構(gòu)蛋白基因2A、3CD串聯(lián)起來，同時加入心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)，構(gòu)建核酸疫苗，并注射到豬體內(nèi)，部分豬可以抵抗口蹄疫強(qiáng)毒的攻擊。Shueh等為增強(qiáng)免疫效果將核酸疫苗和亞單位疫苗聯(lián)合使用，獲得了抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力。

2.5 標(biāo)記疫苗 經(jīng)口蹄疫滅活免疫后，動物經(jīng)常出現(xiàn)隱形感染和持續(xù)帶毒的情況，一般認(rèn)為滅活疫苗中除去絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，免疫動物幾乎不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而感染動物體內(nèi)具有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此，經(jīng)常使用檢測血清中非結(jié)構(gòu)抗體的方法區(qū)分免疫動物中的感染動物。新型疫苗出現(xiàn)后面臨與滅活疫苗同樣的問題，為了便于在實驗室區(qū)分疫苗免疫動物和感染動物，近年來出現(xiàn)了一些能夠進(jìn)行鑒別診斷的標(biāo)記疫苗?？谔阋邩?biāo)記疫苗，是缺失了病毒某段致病相關(guān)基因或優(yōu)勢表位基因的弱毒苗或滅活苗。利用反向遺傳操作技術(shù)，即可有目的缺失基因，構(gòu)建標(biāo)記病毒，同時也可修飾抗原表位基因，拓展病毒抗原譜。在研究標(biāo)記疫苗的同時，也要研發(fā)相應(yīng)的鑒別診斷技術(shù)，只有鑒別診斷成熟的新型疫苗才是標(biāo)記疫苗。劉在新等已完成口蹄疫O型標(biāo)記滅活疫苗的實驗室研究，進(jìn)入臨床試驗階段。

2.6 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，沒有感染性，其結(jié)構(gòu)與病毒相似，可以通過與病毒相同的途徑傳遞給免疫細(xì)胞，并有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，多數(shù)病毒衣殼蛋白基因都已經(jīng)能夠在表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)并自我組裝，這為病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)提供了便利條件。病毒樣顆粒在人用疫苗的研究非常廣泛，并已有商品疫苗投入市場，但在獸醫(yī)疫苗領(lǐng)域開始相關(guān)研究時間較短。孫世琪等用大腸桿菌原核表達(dá)口蹄疫VP0、VP3和嵌合型VP1在體外組裝出嵌合型FLAG外源多肽口蹄疫病毒樣顆粒，外源蛋白插入沒有影響病毒樣顆粒的空間結(jié)構(gòu)，這項研究為口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。郭慧琛等利用泛素化原核系統(tǒng)，研制的VLPs疫苗效力與滅活苗相當(dāng)，達(dá)到了OIE和中國口蹄疫滅活疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。周國輝等Asia1口蹄疫的Asia1/YS/CHA/05毒株的感染中能夠形成口蹄疫病毒樣顆粒，并在病毒傳代過程中穩(wěn)定表達(dá)。用這種疫苗免疫小鼠，可誘導(dǎo)高水平中和抗體，并能持續(xù)長時間?？谔阋卟《緲宇w粒具有活病毒的很多免疫活性，但是沒有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，因此口蹄疫病毒樣顆粒疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。

2.7 標(biāo)記疫苗 近年來，反向遺傳學(xué)技術(shù)為研究病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、病毒復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理等提供了有效的方法，與此同時，也為反向遺傳疫苗的研究開創(chuàng)了一片新天地。反向遺傳疫苗是通過反向遺傳技術(shù)實現(xiàn)對病毒基因的改造和修飾，獲得預(yù)期生物特性的毒株，以提高生產(chǎn)性能、抗原匹配性、免疫應(yīng)答能力和生物安全性等特征。Fowler等將O1BF和C3RES的VP1G-H的130~157位點替換A12毒株相應(yīng)位點，并制備了單價疫苗、動物實驗顯示該疫苗能夠?qū)ε：拓i等抵抗強(qiáng)毒攻擊。鄭海學(xué)等用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建疫苗種毒Re-A/WH/09株并成功研制疫苗，解決了田間毒株產(chǎn)量低、抗原不穩(wěn)定、不適于作為種毒的難題。將Re-A/WH/09與Asia1型和O型疫苗種毒組合，研制出口蹄疫三價滅活疫苗。該疫苗對各流行毒的PD50均大于9.0，高于OIE推薦的常規(guī)疫苗3個PD50緊急免疫接種疫苗大于6個PD50的國際標(biāo)準(zhǔn)。李平花等以以O(shè)/HN/93疫苗毒株的感染性克隆為骨架，用豬毒系病毒的部分VP3和VP1基因替換疫苗毒株的相應(yīng)部分，構(gòu)建了嵌合的口蹄疫病毒全長cDNA克隆。該嵌合病毒的成功拯救為口蹄疫病毒嵌合疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。反向遺傳技術(shù)雖然有諸多優(yōu)點，為新疫苗的研發(fā)開辟了一條新途徑，但它也存在生物安全風(fēng)險，研究人員在試驗設(shè)計中應(yīng)考慮如何避免毒力返強(qiáng)的問題。

本文介紹了近幾年研究有一定發(fā)展前景的幾種新型疫苗。新型疫苗相比滅活疫苗在安全性上更有優(yōu)勢，可根據(jù)需要制備同一種病毒多個成分或多價病毒疫苗，而且大幅度降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點，因此新型疫苗是未來的發(fā)展方向。但新型疫苗在免疫效果方面還存在諸多問題。隨著生物工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，新型疫苗存在的問題必定得到解決。

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