LAMP技術(shù)在家禽腹瀉性疾病檢測中的應(yīng)用

董雯雯 張世棟 王春玲 艾洪新 李新華 潘力 朱偉 李峰*

LAMP技術(shù)在家禽腹瀉性疾病檢測中的應(yīng)用

董雯雯①張世棟①王春玲①艾洪新①李新華①潘力①朱偉②*李峰①*

（②山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所 山東 濟南 250023 ②山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊）

快速檢測致病微生物是控制疾病暴發(fā)的有效方法之一。目前，測病原體的傳統(tǒng)方法耗時且勞動強度大，并且通常很容易失去最佳控制疾病的機會。因此，迫切需要一種快速檢測疾病的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)是近年來新建立的核酸恒溫快速擴增技術(shù)。它具有高靈敏度，特異性，視覺檢測和對儀器的低需求。它具有節(jié)省時間和精力等諸多優(yōu)點，在分子診斷領(lǐng)域具有很大的潛力。目前，LAMP已被廣泛用于檢測各種動物病原微生物。本文主要綜述了LAMP技術(shù)在家禽腹瀉病原微生物檢測中的應(yīng)用以及LAMP技術(shù)的改進和優(yōu)化，為快速檢測家禽腸道疾病提供了參考。

目前，熒光定量、間接免疫熒光等分子生物學(xué)技術(shù)在家禽病原檢測中起著關(guān)鍵作用，但都需要昂貴的儀器設(shè)備及一定操作技能。一旦出現(xiàn)疫情，基層養(yǎng)殖場及實驗室很難實現(xiàn)對病原的快速檢測[1]。針對這一現(xiàn)象，Notomi等[2]于2000年研發(fā)出一種新的DNA擴增技術(shù)-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LA MP)。該方法在各項指標上優(yōu)于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，且不需要昂貴的儀器設(shè)備、簡便、快速、靈敏，僅需在引物及BstDNA聚合酶的催化下，等溫水浴30~ 60min，即可實現(xiàn)靶基因109倍擴增[3]，檢測成本較低，適合基層地區(qū)開展病原微生物的早期診斷和篩查。目前LAMP的檢測對象已經(jīng)覆蓋了核酸、蛋白質(zhì)、細胞等，展現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 LAMP技術(shù)原理

（1）LAMP技術(shù)是在等溫(60~65℃)條件下利用BstDNA聚合酶和靶基因4條特異性引物進行反應(yīng)，最后實現(xiàn)基因的指數(shù)型擴增，具有高度靈敏性和特異性。本項技術(shù)針對設(shè)計的4條特異性引物具有嚴格的要求，分別為正向內(nèi)部引物FIP，反向內(nèi)部引物BIP，正向外部引物F3和反向外部引物B3。這幾對引物的特點是能夠同時識別目標序列的6個特異性片段，從而賦予LAMP很高的特異性[4]。（2）LAMP反應(yīng)在BstDNA聚合酶的催化下進行，F(xiàn)IP，F(xiàn)3與模板序列結(jié)合，形成循環(huán)模板，在F3延伸過程中，F(xiàn)IP產(chǎn)生的延伸鏈被置換出來，與5’端進行堿基互補配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。BIP與B3再以此為模板序列，在BstDNA聚合酶的作用下進行下一輪鏈置換反應(yīng)，形成啞鈴狀單鏈DNA，被置換的鏈自身形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)接著與內(nèi)引物結(jié)合進行擴增和鏈置換，新合成兩倍長度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，最后形成多個重復(fù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]。此外，在反應(yīng)體系中加入兩條環(huán)引物可大大縮短檢測時間，提高檢測效率。

2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測

2.1 電泳檢測法

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物為多個不同長度的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)DNA混合物，可通過瓊脂糖凝膠電泳方法進行鑒定。結(jié)束反應(yīng)后，取10μl產(chǎn)物，加入熒光染料進行電泳，最后用紫外凝膠成像系統(tǒng)進行分析。對陽性樣品進行電泳呈現(xiàn)階梯狀目的條帶。

2.2 濁度檢測法

（1）由于LAMP反應(yīng)放大效率高，反應(yīng)過程中可消耗大量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，dNTPs被消耗使用后則產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，該離子會與溶液中Mg2+結(jié)合而產(chǎn)生焦磷酸鎂，而使反應(yīng)液呈現(xiàn)白色。因此，經(jīng)肉眼觀察反應(yīng)液的渾濁度也可以作為一種判定標準。（2）還可以用濁度儀在400nm波長下檢測反應(yīng)是否發(fā)生，并且可以對產(chǎn)物進行實時定量檢測[6]，簡單快捷。與實時熒光定量PCR儀相比，濁度儀價格便宜，是比較常用的檢測工具。

2.3 熒光檢測法

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物還可以通過加入SYBR Green I、鈣黃綠素等熒光染料/金屬離子指示劑進行判斷。SYBRGreenI在游離狀態(tài)下通常顯示微弱熒光，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強度增強，LAMP陽性反應(yīng)過程中在SYBR Green I 指示下反應(yīng)液由原色橘黃色轉(zhuǎn)為陽性綠色。鈣黃綠素則是另一種LAMP熒光指示劑，在陰性反應(yīng)下，鈣黃綠素會與反應(yīng)液中加入的錳離子結(jié)合，熒光消失。陽性反應(yīng)中產(chǎn)生的焦磷酸根離子與錳離子結(jié)合，釋放鈣黃綠素，鈣黃綠素再與溶液中鎂離子結(jié)合，熒光增強。此種檢測方法簡單便捷，整個反應(yīng)過程不需要開蓋即可進行結(jié)果判斷，避免交叉污染。

3 LAMP技術(shù)在致家禽腹瀉疾病檢測的應(yīng)用

3.1 家禽細菌性腹瀉疾病檢測

3.1.1 禽致病性大腸桿菌的檢測 禽致病性大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌引起各日齡禽類多種病的總稱，該病易引起混合感染，造成極大經(jīng)濟損失。梁玉林等[7]針對大腸桿菌O157保守序列rfb E設(shè)計兩對特異性引物，通過引物篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了檢測大腸桿菌的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法。對比PCR方法結(jié)果顯示，RT-LAMP方法在等溫65℃條件下，30min內(nèi)能完成擴增反應(yīng)，所建立的RT-LAMP方法具有較強的特異性。同時該方法靈敏度能達到20 CFU/g，高出PCR方法10倍。

3.1.2 沙門氏菌的檢測 沙門氏菌病是一種常見的重要人畜共患病原菌，嚴重危害家禽腸道健康，本病發(fā)病率高，造成嚴重經(jīng)濟損失。李迎曉等[8]建立了一種沙門菌LAMP檢測方法，依據(jù)GenBank公布的沙門菌屬fimY基因序列，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，并對其特異性和敏感性進行了評價。結(jié)果表明，LAMP方法具有較強的特異性，最低可檢出濃度為56×102CFU/ml，靈敏度高于PCR方法10倍。王瑾等[9]根據(jù)沙門氏菌inv A基因保守序列設(shè)計特異性引物，利用Midori Green新型核酸熒光染料，建立了沙門氏菌實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(reahime fluorescence LAMP，RTF-LAMP)檢測方法，檢測過程僅需45min，靈敏度達6CFU/管，其靈敏性和準確性與國標檢測方法相當(dāng)，但檢測時間可縮短至7h。

3.1.3 金黃色葡萄球菌的檢測 葡萄球菌是由金黃色葡萄球菌等感染引起的人畜共患傳染病，目前已產(chǎn)生多數(shù)耐藥性，因此快速、準確檢測耐藥性細菌對于預(yù)防此類細菌感染具有重要意義。張濤濤等[10]根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc中的保守序列設(shè)計特異性引物，建立并優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果表明，在環(huán)引物的作用下，LAMP反應(yīng)體系于60℃反應(yīng)35min即可完成擴增，未加環(huán)引物下則需45min才能看到白色絮狀沉淀。對保存到的其他菌株進行同步檢測，發(fā)現(xiàn)對2株金黃色葡萄球菌均顯示陽性，其他菌株顯示陰性，LAMP檢測最低檢測限為100 fg，低于PCR最低檢測限2個數(shù)量級。

3.1.4 巴氏桿菌的檢測 禽巴氏桿菌病又稱禽霍亂，該病主要引起多種家禽、野禽發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難，發(fā)病率及死亡率較高，目前尚無良好的治療方法，嚴重損害養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟效益。為建立同時檢測大腸桿菌、禽源多殺性巴氏桿菌和鴨疫里默氏菌等水禽常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法，程等人[11]根據(jù)大腸桿菌的gapA基因、禽源多殺性巴氏桿菌的KMT1基因、鴨疫里默氏菌的OmpA基因序列，分別設(shè)計引物、標記至豬線粒體基因片段的兩端，制備不同細菌的捕獲探針，將捕獲探針與待檢測菌的基因組雜交、補平缺口、環(huán)化。采用1對引物反向擴增捕獲探針，建立檢測水禽3種常見病原菌的環(huán)介導(dǎo)間接PCR方法，特異性檢測中沙門菌、金黃色葡萄球菌、小鵝瘟病毒的檢測結(jié)果為陰性。該方法能檢測出100pg的細菌基因組DNA，與常規(guī)PCR的符合性為100%。

3.1.5 鴨疫里默氏桿菌的檢測 鴨疫里默氏桿菌是鴨產(chǎn)業(yè)中最有害的傳染性病原體之一[12]，感染鴨群主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、下痢等。陳紅梅等[13]利用RA ompA蛋白基因保守序列設(shè)計并合成兩對LAMP特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，驗證得到在65℃孵育80min，即可達到擴增效果，本方法對大腸桿菌、沙門氏菌等檢測均為陰性，靈敏性試驗發(fā)現(xiàn)該方法對RA ompA最低檢測限度為800fg。Han等[14]針對RA GroEL基因保守片段，設(shè)計了3對LAMP特異性引物，建立了一種適用于RA多種基因型的LAMP檢測方法。該方法能在65℃恒溫下，20min內(nèi)即可實現(xiàn)對目的核酸的擴增，可以檢測出細菌量的最低限度為l0CFU，其靈敏度為普通PCR50倍。

3.2 家禽DNA病毒性腹瀉疾病檢測

3.2.1 禽腺病毒的檢測 禽腺病毒(FAdV)在臨床上主要為包涵體感染，繼而出現(xiàn)呼吸道感染、出血性腸炎，及產(chǎn)蛋量降低，造成一定經(jīng)濟損失。白元斌[15]根據(jù)GenBank已公布禽腺病毒血清4型(FAdV-4)Hexon基因序列設(shè)計兩對LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)體系為61℃，反應(yīng)30 min。與普通PCR檢測相比LAMP方法具有更高的靈敏度，檢測下限為6.4fg/μl。對采集的臨床發(fā)病雞21份肝臟樣品進行檢測，常規(guī)PCR檢出率19%，LAMP檢出率26%。Zhai等[16]研究出用于檢測FAdV-4的循環(huán)介導(dǎo)等溫擴增耦合與側(cè)向流量試紙(LAMP-LFD)，優(yōu)化的LAMP-LFD可在65℃下60 min內(nèi)完成反應(yīng)，與其他方法比較發(fā)現(xiàn)LAMP-LFD可以應(yīng)用于FAdV-4的診斷，特別是在資源有限的地區(qū)。

3.2.2 鴨瘟病毒的檢測 鴨瘟病毒(DPV)引起多種禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，該病流行廣泛，發(fā)病率和死亡率高[17]。馬麗麗等[18]設(shè)計3對LAMP特異性引物擴增DPV UL6保守序列，靈敏性試驗發(fā)現(xiàn)本方法可檢測0.1fg核酸，對其他病原體檢測均為陰性，優(yōu)化試驗得出該體系在水浴鍋中1h內(nèi)即可完成反應(yīng)。張坤等[19]人根據(jù)DPV基因組序列，設(shè)計3對LAMP特異性引物，優(yōu)化篩選發(fā)現(xiàn)該引物在63℃恒溫反應(yīng)1h即可實現(xiàn)目的核酸的鑒定，此外，該檢測方法可在反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBRGreenI染料即可實現(xiàn)眼觀判斷，該方法敏感性可達0.245μg/L，高于普通PCR近10倍，對其他病毒無交叉反應(yīng)，對40份臨床樣品陽性檢出率高達30%。本方法檢測手段簡便快捷，適用于基層實驗室快速、準確檢測DPV。

3.2.3 番鴨細小病毒的檢測 番鴨細小病毒(MPV)可引起3周齡內(nèi)雛番鴨腹瀉等，病死率可達40%~50%以上，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴重的傳染病之一[20]。孟婷等[21]根據(jù)GenBank中公布的MDPVVP3保守序列設(shè)計LAMP特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，最終確定該方法在63℃恒溫反應(yīng)1h即可完成高效反應(yīng)，此外該方法針對核酸的最低檢測限為1×10-2ng/μl，且與其他病原微生物不發(fā)生反應(yīng)。該方法的建立為研制番鴨細小病毒的LAMP快速檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

3.3 家禽RNA病毒性腹瀉疾病檢測

3.3.1 新城疫病毒的檢測 新城疫(ND)是我國重點防控的重大動物疾病之一，針對此類病毒已經(jīng)建立多種實驗室檢測方法，但是依然存在耗能大，耗時長，需要昂貴設(shè)備及專業(yè)人員操作等諸多弊端，限制在基層部門的推廣。鄭鳴等[22]針對AIV HA基因和NDV F基因設(shè)計特異性探針，建立了AIV和NDV雙重環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測方法，該方法特異性高，對AIV和NDV核酸樣品檢測的最低極限質(zhì)量濃度分別為25.0，12.5μg/L。錢科等[23]選取NDV融合蛋白基因(F 基因)設(shè)計了2對特異性引物，對甜菜堿濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度等LAMP反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)條件及特異性、敏感性等進行研究，建立了一種特異性檢測NDV的LAMP方法，該方法最低能檢測到10個拷貝數(shù)的病毒核酸，且向反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ可直接觀察樣品是否含有NDV。

3.3.2 禽流感病毒的檢測 禽流感(AI)是近幾年來危害家禽健康的重要疾病，針對該病毒的檢測主要有常規(guī)PCR、血凝血抑實驗，耗時較長。黃書林等[24]針對H5亞型HA基因8個保守區(qū)域設(shè)計了3對擴增引物，在63℃反應(yīng)1h，可檢出102拷貝的目的基因，比RT-PCR方法敏感約10倍。另外對AIV、NDV和傳染性支氣管炎病毒檢測為陰性。臨床驗證表明RT-LAMP方法陽性檢出率高于RT-PCR方法。Nakauchi等[25]利用RT-LAMP技術(shù)檢測禽流感A(H7N9)病毒，測定顯示其他亞型流感病毒沒有交叉反應(yīng)性；靈敏度試驗驗證RT-LAMP可測定42.47拷貝數(shù)；該檢測方法具有高特異性和靈敏度，是一種很有應(yīng)用前景的禽流感A(H7N9)病毒快速診斷工具。

3.3.3 鴨坦布蘇病毒的檢測 鴨坦布蘇病毒病(DTMUVD)致蛋鴨產(chǎn)蛋率大幅下降，該病較易誤診，因此建立快速高效檢測方法尤為重要。Tank等[26]針對DTMUV NSS基因序列設(shè)計特異性引物，并在反應(yīng)體系添加尿嘧啶DNA糖基化酶，建立了UDC-rRT-LAMP檢測方法。通過對81份臨床樣品進行比對試驗發(fā)現(xiàn)，UDC-rRT-LAMP方法和RT-PCR方法的一致性達到96.88%。吳植等[27]根據(jù)GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列設(shè)計了1套引物，通過優(yōu)化反應(yīng)，建立了RT-LAMP擴增方法。結(jié)果顯示，該方法靈敏度是常規(guī)RT-PCR100倍，對其他常見禽源病毒無特異性擴增。

4 LAMP技術(shù)改進與優(yōu)化

目前，LAMP已經(jīng)成功用于臨床檢測，為進一步提高檢測技術(shù)的靈敏及準確度，仍需對LAMP技術(shù)進行完善更新。以LAMP為基礎(chǔ)的多項應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)被大量開發(fā)。

4.1 多重LAMP

與普通多重PCR相似，多重LAMP針對多個病原微生物設(shè)計2/3對特異性引物，以達到一次擴增反應(yīng)即可同時鑒定出多重病原微生物的目的，大大提高病檢效率。Stratakos等[28]成功設(shè)計針對非致病性與毒素大腸桿菌多重LAMP引物，特異性結(jié)果顯示良好。Rui等[29]針對四種按蚊和兩種瘧原蟲保守基因，通過新開發(fā)的DNA提取方法實現(xiàn)目標DNA的制備，同時建立多重LAMP方法，該方法靈敏度大于95%，特異性達100%。

4.2 橫向流動試紙條

2008年Kiatpathomchai[30]首次將橫向流動試紙條技術(shù)與LAMP技術(shù)結(jié)合(LAMP-LFD)，用于病原快速檢測。反應(yīng)中，F(xiàn)ITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物特異性雜交，與膠體金標記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，并結(jié)合在橫向流動試紙條具有生物素抗體的檢測線上，未雜交的FITC標記探針與膠體金標記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過檢測線，結(jié)合在控制線上。最后通過檢測帶即可判斷擴增產(chǎn)物的有無。目前該項技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于弓形蟲[31]，沙門氏菌[32]等，該技術(shù)實現(xiàn)安全、快速、高效、無需設(shè)備及檢測人員技術(shù)限制，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 LAMP-ELISA

將LAMP與ELISA技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，通過酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的差異，反應(yīng)擴增目的基因的數(shù)值，該方法可增強擴增結(jié)果的可靠性及準確性。Lee[33]等將LAMP與ELISA聯(lián)合檢測結(jié)核分枝桿菌分離株的多藥耐藥性。該方法對靶抗藥基因熱點區(qū)域的點突變設(shè)計引物，采用LAMP、雜交和熱熔法鑒別同源雙鏈DNA(藥物敏感染色體)和異源雙鏈DNA(抗體突變體)。以ELISA比色檢測，在藥物敏感菌株中產(chǎn)生顏色變化。該LAMP-PCR-雜交-熱熔-ELISA(LAMP-TM-ELISA)方法與自動BACTEC MGIT 960系統(tǒng)的比較顯示該分子分析對異煙肼，利福平，阿米卡星和環(huán)丙沙星耐藥性的敏感性，結(jié)核病分別為92.3%，95.3%，93.1%和91.4%。該方法對檢測人員的健康不構(gòu)成威脅，值得推廣應(yīng)用。

4.4 數(shù)字聯(lián)合技術(shù)

數(shù)字微流體是目前分子診斷領(lǐng)域新型平臺，與LAMP技術(shù)結(jié)合使該技術(shù)得到突破性發(fā)展[34]。夏赟[35]首先建立了一種半封閉式的微流控旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片平臺，并將其成功應(yīng)用于可視化LAMP檢測中。隨后，基于泊松統(tǒng)計及化學(xué)計量學(xué)基本理論，建立了數(shù)字等溫擴增定量檢測方法的數(shù)學(xué)模型，利用科學(xué)計算與可視化工具對該模型進行了蒙特卡洛模擬分析并驗證了計算方法的有效及可靠性。該芯片方法能有效跨越4個數(shù)量級濃度的病原菌基因組進行核酸定量分析，結(jié)果與實時熒光定量結(jié)果一致。孔文等[36]整合LAMP和微流控芯片技術(shù)，建立微流控RT-LAMP快速檢測方法，針對甲型H1N1流感病毒的M基因序列中8個不同區(qū)段設(shè)計LAMP引物篩選出1套引物，所建立的檢測方法可實現(xiàn)擴增結(jié)果的熒光實時判讀，可在65℃ 30min內(nèi)完成擴增反應(yīng)，檢測限可達10copies/μl。

5 LAMP展望

LAMP是一項極具實用且高突破性的快速核酸診斷技術(shù)。相比于傳統(tǒng)檢測方法，LAMP操作簡單，便捷，不需要昂貴PCR儀，極大縮短檢測時間，適用于在條件有限地區(qū)的推廣應(yīng)用，LAMP方法已被成功用于細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原的分子生物學(xué)檢測和診斷。此外，以LAMP為基礎(chǔ)的多重LAMP技術(shù)、LAMP-ELISA、LAMP與數(shù)字核酸技術(shù)聯(lián)合、納米金-LAMP等不斷被開發(fā)利用，針對LAMP檢測試劑盒也已經(jīng)用于出售及專利申請，為該技術(shù)的普及和推廣提供一定的技術(shù)支持，目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)品化。但LAMP技術(shù)也存在假陽性、引物要求高、結(jié)果判斷單一等不足，目前針對此類缺陷，各研究學(xué)者正努力在不斷開發(fā)新LAMP-LFD技術(shù)，Primer Explorer引物設(shè)計軟件等方面進行突破。相信在未來，隨著科學(xué)研究的不斷深厚，LAMP檢測技術(shù)將會作為逐步滲入至基層養(yǎng)殖場，極具推廣應(yīng)用前景。

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（2019–09–24）

山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室開放課題（SDPDI201808）

S858.3

B

1007-1733(2019)12-0092-05