腸道類器官的培育、功能、在腸疾病模型和藥物測(cè)試中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王雨佳，沈洪

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210000)

腸道是消化器官中最長(zhǎng)的管道，與一系列腸道疾病有關(guān)，如慢性炎癥性腸病(IBD)、腸梗阻、痢疾、結(jié)直腸癌(CRC)等[1,2]。盡管大量腸疾病研究已在永生化細(xì)胞或動(dòng)物模型中開(kāi)展，但由于腸道不同部位的組織具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理功能，使用單一的離體細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，很難模擬人體腸道的結(jié)構(gòu)、功能以及疾病發(fā)生過(guò)程，導(dǎo)致研究結(jié)果具有局限性。腸道是來(lái)源于內(nèi)胚層的重要器官，2007年Clevers團(tuán)隊(duì)首次證明LGR5+干細(xì)胞位于腸道隱窩的基部，形成腸道干細(xì)胞的生態(tài)位，可分化形成腸道上皮細(xì)胞，如腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞[3]。隨后，該團(tuán)隊(duì)首次在離體3D培育體系中，將腸道干細(xì)胞或隱窩，誘導(dǎo)形成含有潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞的空腔樣“迷你腸”，即腸道類器官。腸道類器官培育方法的開(kāi)創(chuàng)性提出，不僅可用來(lái)研究腸道發(fā)育進(jìn)程，而且為患者提供了個(gè)體化疾病模型或個(gè)體化腸道組織修復(fù)供體，可用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和腸道疾病特異性藥物研究?，F(xiàn)將腸道類器官的培育、功能及其在腸疾病模型和藥物測(cè)試中的應(yīng)用研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 腸道類器官的培育、功能

近些年，器官樣組織培育平臺(tái)得到快速發(fā)展，以模擬在體組織發(fā)育進(jìn)程、構(gòu)建疾病模型等，如肝、胰腺、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腸道類器官[4]。在過(guò)去十年中，體外培養(yǎng)和維持腸上皮細(xì)胞(IEC)的技術(shù)取得重大突破。同時(shí)LGR5+干細(xì)胞的特異性標(biāo)記和腸道干細(xì)胞生態(tài)位的確定[3]，為3D腸道器官樣組織的培育奠定基礎(chǔ)，使得離體擴(kuò)增腸上皮成為可能。2009年，Clevers團(tuán)隊(duì)首次培養(yǎng)出了3D腸道類器官[5]。離體的腸道干細(xì)胞或隱窩在基質(zhì)膠以及多種生長(zhǎng)因子中培養(yǎng)可不斷增殖，并且能夠分化出潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞等各種成熟細(xì)胞，不僅自我組建形成具有多個(gè)隱窩的空腔樣結(jié)構(gòu)，而且保留了腸道干細(xì)胞的自我更新及分化能力[5]。隨后，2015年，Wang等[6]利用成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)和氣液界面三維分化技術(shù)，成功培養(yǎng)出可在體外長(zhǎng)期保持良好自我更新?tīng)顟B(tài)的干細(xì)胞，適用于所有柱狀上皮組織來(lái)源的成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和分化，進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)分化后，可自發(fā)形成各種3D腸上皮組織，如胃、小腸、結(jié)直腸、肝管、胰腺導(dǎo)管等組織器官，該上皮組織具有完善的上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能。

1.1 腸道類器官的培育方法 大量研究[7]表明，在蛋白因子和細(xì)胞外基質(zhì)支架供應(yīng)充足的情況下，來(lái)源于小鼠、人或其他種屬的IEC(包括小腸、結(jié)腸和胎兒腸)，均可自我組建形成獨(dú)特的3D組織樣結(jié)構(gòu)，而且干細(xì)胞擴(kuò)增速度非常快。目前，腸道類器官有兩種方法培育而得，即通過(guò)成體患者供體的腸道隱窩分離獲得，或者通過(guò)人胚胚胎干細(xì)胞(hESCs)或人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSCs)離體分化而得。

無(wú)論是原代組織，還是干細(xì)胞來(lái)源的類器官，其培養(yǎng)條件基本相同，基礎(chǔ)培養(yǎng)基都包含DMEM/F12、N2、B27、煙酰胺、N-乙酰半胱氨酸。此外，還需要向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中額外添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、頭蛋白(Noggin)、胃分泌素(gastrin)等生長(zhǎng)因子，這對(duì)于調(diào)節(jié)腸黏膜生長(zhǎng)和IEC的增殖是必需的。另外，Wnt3a的存在對(duì)于調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞自我更新、增殖和分化是至關(guān)重要的，因?yàn)槟c隱窩干細(xì)胞中LGR5的表達(dá)依賴于經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，且由R-Spondin-1和Noggin的BMP4抑制調(diào)節(jié)[8]。

成體腸組織來(lái)源培育腸道類器官，可在內(nèi)窺鏡檢查或手術(shù)切除期間，從腸道活檢中分離獲得腸隱窩[9,10]。隱窩從上皮手動(dòng)分離后，包埋到含有Wnt、R-Spondin、EGF、Noggin的MatrigelTM中，進(jìn)而在包含所有添加因子和生長(zhǎng)因子的組織培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在接下來(lái)的7～10 d培養(yǎng)過(guò)程中，隱窩逐漸伸長(zhǎng)并擴(kuò)增，形成首個(gè)器官樣結(jié)構(gòu)。成熟的腸樣或結(jié)腸樣組織，不僅包含LGR5+干細(xì)胞，還包含括腸細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞等稱成熟細(xì)胞。人干細(xì)胞來(lái)源的腸道類器官，通過(guò)hESCs或hiPSCs分化發(fā)育形成腸上皮獲得。hESCs或hiPSCs先后經(jīng)歷終末內(nèi)胚層、后腸內(nèi)胚層、腸祖細(xì)胞的2D分化發(fā)育培養(yǎng)階段，之后轉(zhuǎn)移到MatrigelTM的3D培養(yǎng)平臺(tái)，細(xì)胞自發(fā)地重排形成腸道類器官。

1.2 腸道類器官的功能 腸道類器官的功能分析已在多種實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展。由細(xì)胞簇自我組建形成的3D樣腸道類器官，可重現(xiàn)其在體原生組織的重要特征，包括與原生腸上皮相似的、由隱窩和絨毛組成的高度折疊的上皮結(jié)構(gòu)[7]。細(xì)胞簇一旦嵌入到基質(zhì)膠(MatrigelTM)中，開(kāi)始自我組建，上皮的腔表面朝向類器官的中心，基底側(cè)與MatrigelTM和周圍的培養(yǎng)基接觸，逐漸形成腸道類器官。腸道類器官不僅包含在體原生腸組織中的幾乎全部細(xì)胞類型，而且表現(xiàn)出與在體相似的功能，如黏液產(chǎn)生、吸收和分泌功能[11]，可用于研究?jī)?nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病狀態(tài)下不同細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜性。此外，腸道類器官還可模擬在體上皮再生能力，隨著凋亡細(xì)胞逐漸釋放到類器官腔中，隱窩內(nèi)的LGR5+細(xì)胞分化形成新的細(xì)胞，以補(bǔ)充上皮細(xì)胞。

腸細(xì)胞的重要基礎(chǔ)功能是運(yùn)輸水和電解質(zhì)穿過(guò)腸屏障。實(shí)驗(yàn)表明，離體狀態(tài)下，衍生形成的缺乏頂端轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SGLT-1或PEPT1的腸道類器官，可抑制D-葡萄糖、D-果糖和肽類轉(zhuǎn)運(yùn)透過(guò)上皮膜，證明其作為營(yíng)養(yǎng)吸收和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制模型的潛在用途[12]。腸上皮的滲透性可影響小分子穿透腸屏障的擴(kuò)散、阻止細(xì)菌通過(guò)血流移位。最近一項(xiàng)研究[13]證明，腸道類器官可模擬上皮的通透性。通過(guò)將熒光標(biāo)記的葡聚糖注射入腸腔，同時(shí)使用自動(dòng)顯微鏡，可實(shí)時(shí)捕獲并量化活細(xì)胞變化情況、腔表面的斷裂等。該技術(shù)可用于研究慢性炎癥條件下和細(xì)菌入侵期間的腸滲透性的改變。毛喉素誘導(dǎo)的腫脹實(shí)驗(yàn)已在類器官中開(kāi)展，證明囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)離子通道的功能[14]。

2 腸道類器官在腸疾病模型和藥物測(cè)試中的應(yīng)用

腸道類器官于2009年首次提出，在近十年的發(fā)展中，該技術(shù)不僅逐漸應(yīng)用于研究正常腸功能，還用來(lái)研究腸道功能障礙、腸道疾病以及藥物測(cè)試平臺(tái)構(gòu)建。

2.1 腸道類器官在腸疾病模型中的應(yīng)用

2.1.1 IBD IBD是一種病因不十分清楚、可影響整個(gè)胃腸道的慢性的進(jìn)行性、復(fù)發(fā)性疾病，由胃腸道中對(duì)抗抗原的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答失調(diào)而引起。IBD分為潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。UC僅限于結(jié)腸，是結(jié)腸黏膜層和黏膜下層的連續(xù)性炎癥，先累及直腸，逐漸向全結(jié)腸蔓延；CD可影響消化道的任何區(qū)域，為非連續(xù)性全層炎癥，最長(zhǎng)累及的部位為末端回腸、結(jié)腸和肛周[15]。在活動(dòng)性IBD期間，小腸和大腸均可能高度發(fā)炎，導(dǎo)致上皮細(xì)胞破壞和消化能力下降。IBD患者來(lái)源的腸道類器官，可用于模擬IBD患者中先天性免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)模式，以確定新型療法降低疾病嚴(yán)重性的可能性。

腸道類器官主要由上皮組成，包括腸干細(xì)胞自我更新的生態(tài)位，但是缺乏在體中維持腸整體結(jié)構(gòu)和功能的間充質(zhì)組織、免疫和神經(jīng)細(xì)胞。在體外培養(yǎng)環(huán)境下，iPSCS分化獲得的誘導(dǎo)性腸道類器官，移植到小鼠腎囊內(nèi)后，可產(chǎn)生間充質(zhì)，進(jìn)而分化形成平滑肌和成纖維細(xì)胞[11]。這一進(jìn)程雖然能代表體內(nèi)的腸結(jié)構(gòu)，但是耗時(shí)較久，且缺乏最常見(jiàn)的腸道疾病IBD所必需的免疫細(xì)胞。為模擬免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞的相互作用，類器官可以與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，如分離的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，以研究炎癥性疾病的病理學(xué)。

2.1.2 短腸綜合征(SBS) SBS通常由于IBD、CRC或缺血性疾病導(dǎo)致的大腸部分切除而引起，有時(shí)在出生時(shí)就存在。SBS患者的腸上皮表面積顯著減少，伴有吸收障礙、腹瀉和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀。先天性SBS患者，與CLMP基因的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)?；颊邅?lái)源的小腸類器官，為更加深入地研究遺傳易感性提供了可能性，包括發(fā)育過(guò)程中腸道伸長(zhǎng)受損的分子機(jī)制[16]。此外，腸道類器官與延長(zhǎng)小腸的組織工程技術(shù)相結(jié)合，可在不考慮SBS病因的情況下，為恢復(fù)腸道正常功能提供了潛在的方法。

2.1.3 乳糜瀉 乳糜瀉是一種自身免疫疾病的例子，主要影響小腸對(duì)麥膠蛋白(麩質(zhì)食物)的消化，進(jìn)而由于吸收障礙引起炎癥，導(dǎo)致一系列其他連續(xù)性癥狀。若在飲食中不排除所有麩質(zhì)食物，長(zhǎng)時(shí)間的炎癥可能會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、癌癥等。乳糜瀉患者來(lái)源的類器官，可用于深入研究遺傳素質(zhì)和疾病驅(qū)動(dòng)機(jī)制。乳糜瀉患者中腸屏障的完整性，也可通過(guò)類器官進(jìn)行研究[17]。類似地，患者來(lái)源的類器官可用于構(gòu)建藥物篩選平臺(tái)，以鑒定新型療法。

2.1.4 憩室病 憩室病是指腸上皮突出形成的囊狀結(jié)構(gòu)，通常發(fā)生在乙狀結(jié)腸中，由腸道機(jī)械性損傷導(dǎo)致的功能喪失引起[7]。憩室引發(fā)的感染和發(fā)炎，可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)燒、疼痛、惡心和腹瀉。目前，憩室病的病因?qū)W尚不清晰，可能是由于低纖維飲食導(dǎo)致的大腸過(guò)度壓力引起，也可能是先天性遺傳因素引起。因此，通過(guò)相對(duì)無(wú)創(chuàng)地腸組織活檢，培育獲得患者組織來(lái)源的類器官，不僅可用于研究憩室病發(fā)病機(jī)理的遺傳因素，而且可通過(guò)與健康的腸組織進(jìn)行比較，以確定遺傳素質(zhì)和功能差異。由于憩室病疾病進(jìn)程的力學(xué)性能，可對(duì)個(gè)體化類器官施加機(jī)械性壓力，模擬腸道上皮對(duì)不同水平下拉伸力的反應(yīng)。但是，由于在體腸上皮周圍涉及間質(zhì)和肌肉層，單獨(dú)的腸道類器官不適合模擬憩室疾病進(jìn)程，因此需要組織工程方法與類器官技術(shù)相結(jié)合來(lái)模擬憩室病。

2.1.5 囊性纖維化(CF) CF是一種由CFTR突變引起的遺傳性疾病。雖然許多研究表明CF主要作用在肺部，但在腸中也可以觀察到液體和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的改變。研究表[18]明，CFTR突變小鼠和人類CF患者的直腸衍生培養(yǎng)物中可檢測(cè)到CFTR介導(dǎo)的表型。因此，利用患者來(lái)源的腸道類器官，結(jié)合毛喉素誘導(dǎo)的腫脹實(shí)驗(yàn)和電壓門測(cè)量實(shí)驗(yàn)，可精確地測(cè)量流體和離子運(yùn)輸?shù)母淖僛14,18]；同時(shí)，適用于構(gòu)建CF藥物篩選平臺(tái)，以確定CFTR增效劑和基因治療的個(gè)體藥物反應(yīng)[7,14]。

2.1.6 結(jié)腸直腸癌(CRC) CRC是全世界第三最常見(jiàn)的疾病，具有較高的致死率。CRC疾病因素復(fù)雜，但是長(zhǎng)期的CD或UC可顯著增加患CRC的風(fēng)險(xiǎn)。盡管越來(lái)越多的類器官被用作模擬CRC模型，但是目前的CRC模型不能再現(xiàn)早期疾病進(jìn)展，也不能表征腫瘤的異質(zhì)性。因此，類器官技術(shù)可與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，將突變基因引入到目的基因中，例如利用CRISPR/Cas9編輯APC腫瘤抑制基因[19,20]；或?qū)⒒蛐揎椀念惼鞴僖浦驳叫∈篌w內(nèi)，測(cè)量腫瘤發(fā)育和侵襲的體內(nèi)機(jī)制[21]。

2.1.7 食管腺癌 Barrett食管作為癌前病變，在數(shù)十年的再生生長(zhǎng)過(guò)程中，可逐漸演變?yōu)槭彻芟侔?015年，Wa團(tuán)隊(duì)首次在體外3D培養(yǎng)分化獲得Barrett食管干細(xì)胞，進(jìn)而與同一病人來(lái)源的胃干細(xì)胞或食道干細(xì)胞相比，獲得其特異的基因表達(dá)譜[22]。而且Barrett食管干細(xì)胞能分化為腸化生組織的各種細(xì)胞類型，且移植到小鼠體內(nèi)后，可形成類似于人食管腺癌測(cè)腫瘤。因此，以Barrett食管干細(xì)胞作為食道腺癌的靶點(diǎn)，可用于腫瘤預(yù)防和治療研究；以Barrett食管干細(xì)胞分化為腸化生組織，可模擬食管腺癌疾病進(jìn)程。

2.1.8 放射性腸損傷 除以上疾病模型外，類器官模型還可用來(lái)研究腸道損傷，例如放射性腸炎。臨床前動(dòng)物研究表明，輻射后損傷的小腸隱窩增殖再生與轉(zhuǎn)錄阻遏物MTG16、血管心外膜蛋白BVES、STAT5活化有關(guān)。因此，可利用輻射小鼠產(chǎn)生類器官以及直接輻射類器官，建立放射性腸炎模型，用于放射治療后的敏感位點(diǎn)、腸道活力、干細(xì)胞功能和修復(fù)研究。

2.1.9 細(xì)菌和病毒感染模型 腸道是人體抵御外界病原感染的關(guān)鍵屏障，通過(guò)腸道傳播的病毒，包括諾如病毒、輪狀病毒等，都是重要的致病原。但由于細(xì)菌或病毒的附著位點(diǎn)通常位于頂端表面，最常用的3D培養(yǎng)方法不能用于模擬細(xì)菌和病毒感染。為克服這一點(diǎn)，Wang等[6]利用成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)和氣液界面3D分化技術(shù)，不僅在體外更好地模擬和構(gòu)建了腸道上皮的3D結(jié)構(gòu)，而且模擬了艱難梭菌感染腸道而導(dǎo)致的假膜性結(jié)腸炎。該模型的建立，有助于從病理組織學(xué)變化、基因表達(dá)、腸上皮屏障功能障礙等方面深入解析假膜性結(jié)腸炎的發(fā)生過(guò)程和致病機(jī)理，為開(kāi)發(fā)新型藥物和治療方案提供重要的理論依據(jù)。也有研究表明，在Transwells中將腸狀結(jié)構(gòu)培育2D單層細(xì)胞，破壞其3D結(jié)構(gòu)但保留分化能力，允許極化并暴露頂端表面。這一模型，不僅可用于研究屏障功能、轉(zhuǎn)胞吞作用、細(xì)胞極化，也使得該模型易于感染、并檢測(cè)與感染相關(guān)的附著脫落損傷。

2.2 腸道類器官在藥物測(cè)試中的應(yīng)用 人體腸黏膜是藥物吸收、分布、代謝、排泄和毒性的關(guān)鍵位點(diǎn)，但在體外難以重現(xiàn)。盡管腸道類器官可用于腸道研究，包括器官發(fā)育、疾病模型和再生醫(yī)學(xué)，但是缺乏在體解剖學(xué)和生理學(xué)特征。最明顯的特征是，朝向內(nèi)皮方向的類器官閉合腔使頂端表面難以實(shí)現(xiàn)吸收、分布、代謝和排泄測(cè)定。最近一項(xiàng)研究顯示，通過(guò)使用離體細(xì)胞外基質(zhì)或多細(xì)胞合成支架的去細(xì)胞化和再細(xì)胞化構(gòu)建的3D支架，可顯著地增加發(fā)育和疾病模型的準(zhǔn)確性；該方法具有諸多優(yōu)勢(shì)，不僅為細(xì)胞培養(yǎng)成管狀結(jié)構(gòu)提供了基礎(chǔ)，使其具有更加精確的上皮樣圖案和一致的細(xì)胞數(shù)量，而且可根據(jù)研究的腸道區(qū)域或模擬的疾病模型，改變細(xì)胞組成，為局部區(qū)域的腸道提供了一定的解剖學(xué)特征。此外，在腸道組織離體培養(yǎng)中，引入生物打印技術(shù)，生成由人類原發(fā)性IEC和肌成纖維細(xì)胞組成的3D腸組織，可模擬在體原生腸的結(jié)構(gòu)和功能。該3D腸組織，具有緊密連接和特化上皮細(xì)胞類型的極化上皮，表達(dá)功能性和誘導(dǎo)型CYP450酶，不僅發(fā)育形成生理屏障，區(qū)分高滲透性和低滲透性化合物，而且具有功能性P-gp和BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在生化和組織學(xué)方面，3D腸組織可以對(duì)化合物誘導(dǎo)毒性和炎癥損傷產(chǎn)生反應(yīng)。這一方法的開(kāi)創(chuàng)性提出，可與現(xiàn)有的臨床前測(cè)定相兼容，為增強(qiáng)藥物研發(fā)中的安全性和功效預(yù)測(cè)提供新的臨床試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

綜上所述，成體組織活檢或多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的腸道類器官，表型穩(wěn)定，培養(yǎng)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可用于原生腸道發(fā)育、個(gè)體化疾病模型、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和腸疾病特異性藥物測(cè)試等研究。盡管目前的類器官培養(yǎng)技術(shù)不允許組裝復(fù)雜的多細(xì)胞類器官，具有一定的局限性，但是腸道類器官相對(duì)于組織培養(yǎng)細(xì)胞系仍有許多優(yōu)勢(shì)。未來(lái)，腸道類器官與CRISPR/Cas9基因編輯、3D生物打印等新興技術(shù)結(jié)合，可構(gòu)建更加復(fù)雜、更加精確的腸疾病研究平臺(tái)，在腸道疾病基因治療和移植應(yīng)用中發(fā)揮更大的潛力，更好地用于疾病模擬、藥物發(fā)現(xiàn)和個(gè)性化醫(yī)療。我們相信，隨著類器官培育和技術(shù)的快速發(fā)展，腸道類器官在人類腸疾病研究和組織再生醫(yī)學(xué)中，將發(fā)揮不可估量的價(jià)值。