非病毒載體介導(dǎo)的基因治療在骨缺損修復(fù)中的研究進(jìn)展

任超 周諾

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧530021）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，由各種先天性、感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤和骨折引起的骨畸形和骨缺損的數(shù)量在逐年增加。骨組織有一種獨(dú)特的自我修復(fù)能力。然而，在一些臨床病例中，人體無法再生骨導(dǎo)致愈合受損，臨床中不能愈合的骨缺損主要由自體骨、異體骨和骨移植替代物來填補(bǔ)。同種異體骨移植有潛在疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，而臨床自體骨移植治療又有造成供體部位疼痛和缺損、手術(shù)時(shí)間過長(zhǎng)和可供組織量有限等局限性以及骨生長(zhǎng)因子在體內(nèi)半衰期短的問題?；蛑委熆赡苁枪侨睋p的替代療法，使用基因載體將生長(zhǎng)因子傳遞到骨缺損部位，靶基因可持續(xù)和潛在可調(diào)控地誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性骨形成蛋白較外源重組蛋白生物利用度高，內(nèi)源性生長(zhǎng)因子通過在局部的表達(dá)來促進(jìn)損傷部位的修復(fù)和再生，轉(zhuǎn)基因技術(shù)聯(lián)合干細(xì)胞工程修復(fù)骨的缺損擁有著不可估量的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。然而目前大量的實(shí)驗(yàn)研究還僅局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此，在轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前，必須開發(fā)可靠且有特異性的基因載體系統(tǒng)并評(píng)估其功效和安全性?；蜉d體可根據(jù)其來源分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因其具有低免疫原性、成本低廉、制備簡(jiǎn)便、基因攜帶量大等優(yōu)點(diǎn)而成為研究的熱門領(lǐng)域［1］。本文簡(jiǎn)要回顧了非病毒載體的生物學(xué)特性及其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展。

1 非病毒載體的生物學(xué)特點(diǎn)及發(fā)展

通常用于基因治療的病毒載體包括經(jīng)過修飾了的慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等。由于病毒載體與野生病毒一樣對(duì)體細(xì)胞易感，因此其轉(zhuǎn)染效率較高，但仍存在許多難以克服的缺陷。病毒載體可攜帶的目的基因通常受野生型病毒基因組大小的限制，其次，病毒載體制備復(fù)雜，有較嚴(yán)格的儲(chǔ)存運(yùn)輸要求，成本高，最重要的是安全問題，所攜帶的基因序列有可能重組入宿主基因組，有致癌風(fēng)險(xiǎn)以及免疫原性［2］。與病毒載體不同，非病毒載體具有優(yōu)異的生物安全性，低毒性、低免疫原性、外源基因的低整合率，除此以外，攜帶基因的容量大，制備簡(jiǎn)單，易于保存和測(cè)試的優(yōu)勢(shì)使其在基因治療領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛能，然而，限制其被廣泛使用的最重要因素是低轉(zhuǎn)染效率［1］。所有基因載體系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染必須順利完成核酸被遞送至干細(xì)胞、細(xì)胞穿過細(xì)胞膜屏障、逃避內(nèi)吞作用和溶酶體、基因與載體解離并進(jìn)入核屏障四個(gè)階段［3］。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)基因載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究的深入，許多經(jīng)過不斷地優(yōu)化后能夠滿足臨床高效安全要求的非病毒載體被研制出來。目前，臨床試驗(yàn)中常用的非病毒載體有脂質(zhì)體或脂類復(fù)合物、陽(yáng)離子多聚復(fù)合物、多肽蛋白類、細(xì)胞穿透肽、納米材料遞送系統(tǒng)等。在基因增強(qiáng)骨組織工程中研究應(yīng)用較多的是脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物。

1.1 脂質(zhì)體及脂質(zhì)體復(fù)合物 脂質(zhì)體是通過在水中疏水締合的磷脂的有序排列的組合體，并且封閉的微膠囊由一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)樣雙層膜形成，其特殊的結(jié)構(gòu)使脂質(zhì)體具有低毒性、優(yōu)異的生物相容性、可降解性、較大的目的基因包裝能力、易于制備和改性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，當(dāng)DNA 等包封到人體內(nèi)時(shí)，可以防止DNA 被核酸酶降解，并且促進(jìn)內(nèi)體的逃逸以有效輔助基因轉(zhuǎn)移［4］。FELGNER 等［5］在1987年首次使用陽(yáng)離子脂質(zhì)（DOTMA）作為基因轉(zhuǎn)移載體。對(duì)脂質(zhì)體的研究發(fā)展至今，脂質(zhì)體可根據(jù)性能分為多種類型：一般脂質(zhì)體、光敏脂質(zhì)體、熱敏脂質(zhì)體、pH 敏感性脂質(zhì)體和磁性脂質(zhì)體等。根據(jù)電荷的性質(zhì)，脂質(zhì)體將分為陽(yáng)離子脂質(zhì)體、中性脂質(zhì)體和陰離子脂質(zhì)體。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體是當(dāng)前最常使用的非病毒基因傳遞載體。研究者們?yōu)楦牧缄?yáng)離子脂質(zhì)體低轉(zhuǎn)染效率和靶向性的問題使用了眾多方法，包括添加輔助性材料、對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行結(jié)構(gòu)性修飾、研發(fā)設(shè)計(jì)新型脂質(zhì)材料、創(chuàng)新制備工藝等。一些學(xué)者在脂質(zhì)體表面進(jìn)行了聚乙二醇（PEG）-脂質(zhì)修飾，PEG 化脂質(zhì)體的理化性質(zhì)更穩(wěn)定，降低了對(duì)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的識(shí)別攝?。?］。還有研究者從食品級(jí)油脂中提取的脂肪酸混合物（如棕櫚烯脂）制備陽(yáng)離子脂納米載體系統(tǒng)（ps-lip）［7］，因?yàn)槭称芳?jí)的棕櫚酰甘油（三?；视停┖腥舛罐Ⅴ＃–14）到亞油酸（C18：2）的鏈長(zhǎng)，鏈長(zhǎng)變化小，組成均勻穩(wěn)定，增強(qiáng)了對(duì)附著及懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)于核酸的傳遞和基因編輯更有效、更經(jīng)濟(jì)、更安全。制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體的常規(guī)方法包括反向蒸發(fā)法、鈣融合法、凍融法和洗滌劑法等。近年來許多新的生產(chǎn)技術(shù)被研發(fā)出來以提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，有高壓均質(zhì)化方法，優(yōu)化的乙醇注入方法，真空干燥-超聲方法，膜-凍融方法，SUV-融合方法等［8］。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率不僅與陽(yáng)離子脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與載體跟DNA 的比值密切相關(guān)。HAN 等［9］在研究非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)中得到最佳轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子脂質(zhì)體：DNA 用量比例為0.3 μL：80 ng。

1.2 多聚物載體 聚-L-賴氨酸（PLL）［10］是第一種用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的聚合物，隨后許多陽(yáng)離子聚合物作為體外和體內(nèi)基因載體迅速發(fā)展起來，合成型陽(yáng)離子聚合物包括多聚賴氨酸、聚氨酯、聚乙烯甲胺陽(yáng)離子共聚物、聚磷腈類；天然生物陽(yáng)離子聚合物有殼聚糖、環(huán)糊精及其衍生物。陽(yáng)離子聚合物具有優(yōu)異的DNA 結(jié)合和保護(hù)作用，并具有優(yōu)異的生物相容性，生物安全性和易于進(jìn)行化學(xué)修飾的優(yōu)點(diǎn)使其在未來基因治療領(lǐng)域有著無限的應(yīng)用價(jià)值。多聚物的特點(diǎn)是可以利用復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)形成獨(dú)特的構(gòu)象，從而大大提高載體穩(wěn)定性和外源基因的緩釋效果，多聚物上的多種官能基團(tuán)能通過靜電或共價(jià)鍵等方式易于被修飾而改性。

1.2.1 聚乙烯亞胺（PEI） PEI 是近年來發(fā)展最快的基因載體之一。作為化學(xué)原料，PEI使用范圍廣，價(jià)格低廉，來源廣泛。1985年，BOUSSIF 等［11］發(fā)現(xiàn)PEI 具有基因轉(zhuǎn)載的作用。PEI 能作為基因轉(zhuǎn)染載體是由于其氨基含量較高，在生物環(huán)境下能夠發(fā)生“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，可讓復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃逸順利入核［12］。隨后國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)PEI 載體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)一步的研究得出影響PEI 復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的因素有PEI 的相對(duì)分子質(zhì)量、表面電荷密度、PEI 的氨基與DNA 的磷酸基的比（N/P）、復(fù)合物的粒徑等。王清富［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染效率隨著N/P 值的增加而增加，獲得最大轉(zhuǎn)染效率的N/P 為6，為優(yōu)化PEI 傳遞系統(tǒng)和研制新型載體提供理論支持。

PEI 的轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞毒性與PEI 的分子量成正比，因此在使用PEI 作為轉(zhuǎn)染試劑之前，應(yīng)考慮轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性的分子量和濃度之間的平衡。許多研究人員使用特殊基團(tuán)修飾PEI，如雙氨基甲酸酯鍵、惰性可降解聚合物等用于連接低分子量PEI 以通過交聯(lián)或鏈延長(zhǎng)獲得高分子量可降解聚合物，從而達(dá)到增強(qiáng)其特異性和穩(wěn)定性，降低毒性，提高轉(zhuǎn)染效率的作用。PENG 等［14］則分別利用環(huán)糊精和殼聚糖交聯(lián)小分子PEI 來提高其分子量，既能夠達(dá)到一定轉(zhuǎn)染效率，也保存了小分子PEI 生物毒性低的優(yōu)點(diǎn)。HUANG 等［15］首次提出了一種超分子策略，即用大環(huán)葫蘆［7］脲（CB［7］）包裹大分子量PEI（分枝，25 kDa），轉(zhuǎn)染效率高，PEI 的細(xì)胞毒性被顯著抑制，是一種有效的非病毒基因傳遞載體。該策略為降低PEI 和其他陽(yáng)離子基因載體非特異性毒性提供了新的見解。近年來，有研究者打破了“效率-毒性”悖論，LIU 等［16］通過鋅（Zn）對(duì)陽(yáng)離子聚合物（LCPs）的協(xié)同修飾，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和低分子量（降低細(xì)胞毒性）。

PEI 的毒性與其較高的表面電荷密度有關(guān)，降低陽(yáng)離子聚合物細(xì)胞毒性的另一種方法是添加一個(gè)親水層來掩蓋表面的正電荷，比如PEG［17］、普朗尼克［18］、葡聚糖［19］等。憑借靜電力的相互作用，PEI 與DNA 形成的復(fù)合物表面電荷密度和載體的毒性均較PEI 低。有許多報(bào)道認(rèn)為PEI 的內(nèi)體緩沖能力與基因轉(zhuǎn)移效率無關(guān)，膜分解同樣具有細(xì)胞毒性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)DNA 也面臨被降解等風(fēng)險(xiǎn)，故有研究者［20］構(gòu)建組蛋白（H3）修飾PEI，H3 避開了溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)而是利用其效應(yīng)器和Rab6 GTPase 調(diào)控的逆行通路，它極大地提高了將聚合物輸送到細(xì)胞核中的效率，同時(shí)降低了細(xì)胞毒性。改進(jìn)的靶向細(xì)胞核的策略對(duì)于促進(jìn)基因治療在再生醫(yī)學(xué)和許多其他疾病中的發(fā)展至關(guān)重要。

1.2.2 殼聚糖（CS） CS 是一種無生物毒性多糖，是通過甲殼素的脫乙?；纬捎搔?（1，4）糖苷鍵連接的D-葡糖胺和N-乙?；?D-葡萄糖胺亞基組成的聚合物。在1995年MUMPER 等［21］是使用殼聚糖作為基因轉(zhuǎn)移載體的第一位學(xué)者。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖和帶負(fù)電荷的DNA 通過靜電力形成復(fù)合顆粒，并且顆?？梢皂樌卮┩讣?xì)胞膜并完成基因治療。盡管殼聚糖的轉(zhuǎn)染率低，但由于其無與倫比的安全性和優(yōu)異的生物相容性和生物降解性引起了廣泛的關(guān)注。

影響殼聚糖的轉(zhuǎn)染效率的因素包括其自身的結(jié)構(gòu)如分子量、脫乙酰度、殼聚糖／DNA 復(fù)合物的氮磷比（N/P）、粒徑和運(yùn)輸條件如pH、細(xì)胞類型等。研究證實(shí)，殼聚糖分子量越高，保護(hù)細(xì)胞外DNA 能力越強(qiáng)，用于高效基因轉(zhuǎn)染的最佳pH 值為6.8～7.0，最佳電荷比在3～5，最佳血清濃度為10～20 wt%［22］，除此之外，中度脫乙酰的殼聚糖轉(zhuǎn)染效率更高［23］。明確了殼聚糖最佳轉(zhuǎn)染條件后，為其之后的優(yōu)化改性提供了科學(xué)的理論基礎(chǔ)。殼聚糖易于被改性，可以通過制備衍生物或復(fù)合其他材料以提高轉(zhuǎn)染效率。許多研究人員通過增加殼聚糖的電荷密度來提高殼聚巧的轉(zhuǎn)染效率，例如，通過殼聚糖末端胺的N-季銨化來增加電荷密度［24］；用PEG 修飾殼聚糖聚合物［25］；用高電荷密度PEI 接枝改性［26］等。林福星［24］創(chuàng)新性地使用含磷化合物，通過輻射接枝技術(shù)制備聚苯乙烯膦鹽接枝殼聚糖的復(fù)合物（CS-P），基因轉(zhuǎn)染效率從4.59%提高到32.8%。還有研究［27］發(fā)現(xiàn)3-D 礦化藻酸鹽殼聚糖微膠囊是一種低毒性的，具有生物學(xué)和實(shí)用價(jià)值的非病毒基因載體，與許多其他的非病毒載體系統(tǒng)相比，在轉(zhuǎn)染原代骨細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

2 非病毒載體在骨修復(fù)領(lǐng)域的研究

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制研究的深入，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，利用非病毒載體介導(dǎo)內(nèi)源性或外源性的生長(zhǎng)因子來促進(jìn)新骨形成和修復(fù)骨組織缺損已成為國(guó)內(nèi)外前沿研究的熱點(diǎn)。在促進(jìn)新骨的生長(zhǎng)重建和骨缺損的修復(fù)的復(fù)雜過程中，各種細(xì)胞及生長(zhǎng)因子在各個(gè)階段均起到了重要的作用，細(xì)胞因子之間相互作用，對(duì)激素的分泌以及對(duì)細(xì)胞的代謝均起到調(diào)控作用。生長(zhǎng)因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等［28］。

2.1 基于體外基因傳遞的骨再生工程 科學(xué)研究已經(jīng)廣泛證實(shí)了BMP-2 是誘導(dǎo)胚胎骨生長(zhǎng)和成人骨修復(fù)的重要生長(zhǎng)因子。Lip2000 是已實(shí)現(xiàn)商品化的非病毒載體，具有低毒、高效、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格優(yōu)廉等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因治療上。方志輝等［29］利用Lip2000 成功將BMP2 基因載入大鼠的BMSCs 中，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨小梁形成并縮短了骨折愈合的時(shí)間。骨缺損修復(fù)是由多種細(xì)胞及生長(zhǎng)因子共同參與完成的，因此許多研究者通過非病毒載體攜帶多基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，更好的模擬了體內(nèi)生理過程。一些研究人員［30］使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為載體，體外轉(zhuǎn)染干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，BMP2 和VEGF165 聯(lián)合基因以及IGF1 和BMP2 聯(lián)合基因在骨再生中均具有良好的協(xié)同效應(yīng)，外源性基因均得到穩(wěn)定表達(dá)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為非病毒載體其低毒性、出色的生物相容性、較大的DNA 包裝能力等出色的優(yōu)點(diǎn)。FGF-2 和BMP-2 在PEI 遞送下共轉(zhuǎn)染人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hADMSCs）也表現(xiàn)協(xié)同促進(jìn)成骨分化作用［31］。

研究者們?yōu)榱藘?yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性能，許多經(jīng)過結(jié)構(gòu)性修飾或新研發(fā)的類脂質(zhì)體較傳統(tǒng)脂質(zhì)體在體外成骨實(shí)驗(yàn)研究中獲得了較高轉(zhuǎn)染效率以及較低的細(xì)胞毒性。GAO 等［32］從［12］-aneN3 中提取陽(yáng)離子脂質(zhì)并分別用由萘酰亞胺（1a）、油酸（1b）和十八胺（1c）進(jìn)行修飾，3 個(gè)傳遞系統(tǒng)均對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1，MG63，HeLa 和HEK293 細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效率，其中1a 的轉(zhuǎn)染效率比lipofectamine 2000 更高，除此之外它還成功通過非侵入性熒光成像對(duì)細(xì)胞攝取，DNA 轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放進(jìn)行原位監(jiān)測(cè)。因此，筆者得出結(jié)論，1a 作為多功能非病毒傳遞系統(tǒng)，用于治療未來成骨細(xì)胞相關(guān)的各種骨疾病可能是一個(gè)有前途的非病毒基因載體。ATTIA 的研究團(tuán)隊(duì)［33］以陽(yáng)離子脂質(zhì)體2，3-二（十四氧基）丙烷-1-胺為基礎(chǔ)并結(jié)合聚山梨醇酯80開發(fā)了一種新的類脂質(zhì)體載體系統(tǒng)，將BMP-7 基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性、ALP 活性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，證明了他們?cè)O(shè)計(jì)的非病毒載體可以有效的用傳遞BMP-7，促進(jìn)新骨再生，為開發(fā)新的高性能基因載體提供了進(jìn)一步的思路。陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)染的載體在體外的研究應(yīng)用已趨于成熟，為今后開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究以及骨缺損修復(fù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

除此以外，還有許多新型非病毒載體經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同樣能高效地傳遞基因入靶細(xì)胞并穩(wěn)定地表達(dá)蛋白。由CHEN 等［34］設(shè)計(jì)的新型非病毒基因載體PAA-BA 在轉(zhuǎn)染BMSCs 后顯示出成骨分化潛能的增強(qiáng)，這些發(fā)現(xiàn)表明基于PAA-BA 的基因遞送載體可以維持BMSCs 的干細(xì)胞特征，PAA-BA 具有更好的細(xì)胞相容性與安全性。還有研究者38 開發(fā)了一種用聚合物pDNA 納米復(fù)合物涂覆鈦表面以增強(qiáng)骨整合的新方法，筆者發(fā)現(xiàn)，以N/P 比率為10 制備的涂有PEI-pDNA（BMP-2）納米復(fù)合物的圓盤體外轉(zhuǎn)染BMSCs后可有75%的細(xì)胞活力和14%的轉(zhuǎn)染效率，與對(duì)照組相比，成骨標(biāo)志物的表達(dá)較強(qiáng)，并有明顯的鈣沉積，突出了非病毒載體與基因活化的鈦表面結(jié)合后具有增強(qiáng)骨整合的潛力。由于microRNA 在骨再生中穩(wěn)定性差、細(xì)胞攝取低，低免疫原性，WU 等［35］制備了殼聚糖/三聚磷酸鹽/透明質(zhì)酸納米顆粒（CTH NPs），CTH NPs 在向骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遞送抗mir-138 方面顯示出高效率和無毒性，且有較強(qiáng)的骨再生能力。這些研究提示了非病毒載體用于基于BMSCs的基因治療的潛能，特別是骨相關(guān)疾病，為開發(fā)新型高效基因傳遞系統(tǒng)提供了進(jìn)一步的見地。

2.2 基于體內(nèi)基因傳遞的骨再生工程 局部基因治療具有通過將成骨基因局部遞送至骨病變區(qū)持續(xù)地指導(dǎo)受調(diào)蛋白質(zhì)表達(dá)來增強(qiáng)骨缺損愈合和骨再生的潛力?；蚣せ罨|(zhì)（GAM）是由質(zhì)粒DNA 和可生物降解的生物材料作為載體組成的惰性支架系統(tǒng)，通過聚合物支架將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，已被廣泛用于組織工程學(xué)研究。GAM 具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如低免疫原性，可以避免將載體分布到其他組織中，高生物降解潛力和易于大規(guī)模生產(chǎn)等。成骨基因與生物相容性支架的結(jié)合極大地加速了骨愈合。D′MELLO 等［36］開發(fā)并評(píng)估了一個(gè)新的非病毒基因遞送系統(tǒng)的體內(nèi)骨再生的能力，利用膠原支架傳遞聚乙烯亞胺（PEI）-質(zhì)粒DNA（pDNA）復(fù)合物至大鼠顱骨缺損中，植入體內(nèi)后檢測(cè)新骨量/總體積（BV/TV）%非病毒PEI-pPDGF-B 復(fù)合物、PEI-pVEGF-B 復(fù)合物負(fù)載的支架明顯高于空支架，其中PEI-（pPDGF-B+pVEGF）復(fù)合材料促進(jìn)大鼠顱骨缺損的成骨效果最優(yōu)，并顯示出更高的組織再生效率和低細(xì)胞毒性及低免疫原性?；谥按罅垦芯孔C明多種細(xì)胞因子有協(xié)同成骨的作用，KHORSAND 等［37］在糖尿病兔骨干長(zhǎng)骨徑向缺損模型中植入負(fù)載有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）復(fù)合物的膠原支架，在BMP-2 和FGF-2 的協(xié)同作用下骨缺損處有大量新骨再生，因此載有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）的支架可能是促進(jìn)糖尿病患者骨缺損修復(fù)的有效方法，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。還有研究發(fā)現(xiàn)載有含編碼成骨蛋白的cmRNA 的非病毒載體支架的高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性和體內(nèi)成骨潛能而被認(rèn)為可能是促進(jìn)骨再生的有效工具［38］。這些研究為未來臨床應(yīng)用非病毒基因載體治療各種原因所致的骨缺損修復(fù)的可行性和有效性提供了理論基礎(chǔ)。

宿主細(xì)胞的高轉(zhuǎn)染效率和安全性是體內(nèi)有效基因轉(zhuǎn)染所必需的。許多研究者開發(fā)并評(píng)估了用于體內(nèi)骨再生的組合非病毒基因載體的可行性和有效性。趙亮［26］采用共價(jià)交聯(lián)法制備的CS-PEI/hBMP-2 納米粒子在體外能有效轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細(xì)胞并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化的能力，將CS-PEI/hBMP-2 復(fù)合至明膠海綿支架上，植入到大鼠顱骨骨缺損處12 周后通過Micro CT 及組織學(xué)染色觀察結(jié)果表明CSPEI/hBMP-2 納米粒子能促進(jìn)新骨形成，并且沒有明顯的體內(nèi)毒性。YUE 等［39］也通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CS-PEI/hBMP-2 具有體內(nèi)外促進(jìn)成骨分化的能力，促進(jìn)骨組織分化，修復(fù)骨缺損。CS-PEI 在轉(zhuǎn)染效率和生物安全性方面均優(yōu)于PEI 和Lipofectamine，是一種很有前途的非病毒載體，在干細(xì)胞基因治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。除此之外，nGO-PEG-PEI 因其較高的siRNA 傳遞效率和持續(xù)的靶基因沉默而被認(rèn)為可能是一種有前途的siRNA 載體，研究者通過制備納米級(jí)的PEG 和PEI 雙功能化氧化石墨烯（GO；nGO-PEG-PEI），再通過陽(yáng)極氧化法制備的二氧化鈦納米管（NTs）經(jīng)陰極電沉積，用nGO-PEG-PEI/siRNA對(duì)其進(jìn)行生物氧化得到NT-GPP/siRNA，NT-GPP/siCkip-1 顯著改善了MC3T3-E1 細(xì)胞的體外成骨分化，增加了ALP 的產(chǎn)生、膠原分泌和ECM 礦化，可明顯增強(qiáng)體內(nèi)骨整合，改善了成骨相關(guān)基因表達(dá)［40］。因此筆者認(rèn)為，組合非病毒基因載體應(yīng)用于體內(nèi)骨缺損修復(fù)是可行并且有效的，它集多種非病毒載體的特性于一身，作為一種新型非病毒載體系統(tǒng)，在口腔及整形外科的臨床應(yīng)用有很大的潛力。另有一種小核酸傳遞系統(tǒng)是由成骨細(xì)胞靶向肽（SDSSD）修飾的聚氨酯（PU）納米微粒，它封裝siRNA/microRNA，能有效將藥物靶向傳遞給成骨細(xì)胞且在體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生明顯的毒性或引起免疫反應(yīng)，可作為一種成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨合成代謝病的治療方法。

雖然國(guó)內(nèi)外已有大量基因治療的實(shí)驗(yàn)研究，但是迄今為止，尚未開發(fā)出在臨床上能廣泛應(yīng)用于骨再生領(lǐng)域的基因載體。基于生長(zhǎng)因子的基因治療的主要限制是大型動(dòng)物研究不足，將這些研究轉(zhuǎn)化為人類臨床實(shí)踐仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。眾學(xué)者在非病毒載體介導(dǎo)的基因治療在體內(nèi)外成骨、修復(fù)骨缺損方面的研究結(jié)果均有積極的意義，為進(jìn)一步將基因治療的體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)為體內(nèi)臨床應(yīng)用提供了有價(jià)值的信息。

3 問題與展望

隨著骨再生和骨修復(fù)生物學(xué)研究的深入，基因轉(zhuǎn)染的載體的性能、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)及基因治療方法的不斷優(yōu)化，將基因治療與骨組織工程相結(jié)合，利用誘導(dǎo)因子以持續(xù)性而可控的方式刺激內(nèi)源性生長(zhǎng)因子合成來促進(jìn)骨缺損區(qū)新骨形成，基因傳遞比直接高劑量蛋白質(zhì)遞送更具成本效益，已然成為骨組織工程未來的發(fā)展方向。然而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)仍局限在體外和小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，除此之外，監(jiān)管義務(wù)不到位，財(cái)政支持的限制，安全問題和基因傳遞方式的局限性也是將基因治療納入臨床考慮的主要限制。因此，在轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前，開發(fā)出可靠的、可復(fù)制的基因傳遞方法與有效性和安全性得到保證的合適載體是我們目前共同追尋的目標(biāo)，這也是未來開展基因治療最艱巨的任務(wù)。

基因治療是一個(gè)相對(duì)較新的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，安全是首要考慮因素，在設(shè)計(jì)基因治療的載體時(shí)筆者要考慮幾個(gè)方面，盡量最小化DNA 在宿主基因組中的插入以避免突變的發(fā)生；優(yōu)化傳遞方法以防止血液或組織中DNA 被降解；生產(chǎn)過程中保證載體結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，將毒性降至最低。轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用時(shí)還需要考慮實(shí)際因素，例如患者的年齡、性別、系統(tǒng)性健康狀況以及骨性疾病的性質(zhì)，使基因治療個(gè)性化。理想的基因載體還應(yīng)該對(duì)靶細(xì)胞高度特異且生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸成本適宜。

非病毒載體具有生物毒性低，免疫原性低，基因容量大，外源基因整合率低的優(yōu)點(diǎn)，為其臨床的應(yīng)用提供了更多可能性，以及制備簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模生產(chǎn)、使用方便、靶向性好、易于保存和檢驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有很大的發(fā)展空間，是未來基因攜帶者的主導(dǎo)方向。但非病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間較病毒載體低，這將是非病毒型基因載體臨床應(yīng)用受到限制主要因素。相信隨著基因載體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的深入研究，將會(huì)有越來越多的全新的非病毒基因載體出現(xiàn)，非病毒載體介導(dǎo)的基因治療在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域?qū)?huì)取得更多的研究成果。