應(yīng)重視骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中軟骨損傷的修復(fù)

孟慶奇 李斯明

廣州市紅十字會醫(yī)院，暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會醫(yī)院骨科（廣州 510220）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種可發(fā)生在任何關(guān)節(jié)軟骨及其周圍組織的疾病，最常見發(fā)病部位是膝、髖、手腕等小關(guān)節(jié)。以最常見的膝關(guān)節(jié)OA為例，TANG等［1］報告了有癥狀的膝關(guān)節(jié)OA患病率為8%（定義為自我報告的膝關(guān)節(jié)疼痛并被醫(yī)生診斷為OA），膝關(guān)節(jié)OA在女性中比男性更常見，隨著年齡的增長而增加，直到70歲左右達(dá)到穩(wěn)定水平。據(jù)TIE等［2］報道，中國農(nóng)村的膝OA總患病率為23.6%，男性占15.4%，女性占28.1%；中國城市總患病率為20.0%～23.9%，男性為13.7%，女性為24.3%，中國農(nóng)村和城市的患病率無差異。隨著人口老齡化的進(jìn)程，OA的發(fā)病率及所帶來的醫(yī)療成本無疑會進(jìn)一步增加，尋找OA防治的有效措施更加的必要與迫切。本文就OA的發(fā)病機(jī)制及OA軟骨修復(fù)中涉及的微環(huán)境變化作一概述。

1 OA的發(fā)病機(jī)制

OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，傳統(tǒng)觀點(diǎn)是：年齡、運(yùn)動、肥胖等相關(guān)因素造成的關(guān)節(jié)退行性變，即關(guān)節(jié)內(nèi)的壓力和磨損導(dǎo)致了關(guān)節(jié)軟骨的損傷，而軟骨細(xì)胞再生能力非常差，這是OA及其他類型關(guān)節(jié)炎證治療的難點(diǎn)所在。上世紀(jì)90年代以前一直認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨本身因為沒有血管和神經(jīng)，所以關(guān)節(jié)軟骨不能像其他組織一樣產(chǎn)生炎癥。直到近年來包括前列腺素在內(nèi)的諸多因素被證實可以誘導(dǎo)軟骨產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）（MMPS是關(guān)節(jié)炎早期病變的基礎(chǔ)），OA也逐漸被認(rèn)為是一種炎癥誘導(dǎo)發(fā)生的疾病。1992年MARTEL-PELLETIER發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細(xì)胞對IL-1和MMPs刺激的敏感性高于正常細(xì)胞，而這可能與OA細(xì)胞中表達(dá)的IL-1R水平升高有關(guān)［3］，這也進(jìn)一步證實了軟骨細(xì)胞自身可產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。還有研究者證實軟骨下骨的炎癥反應(yīng)也參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過程［4］。現(xiàn)在可以明確的是OA發(fā)病過程與關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和軟骨下骨的炎癥信號調(diào)控相關(guān)，而關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)的炎癥反應(yīng)是造成關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要原因［5］。

2 軟骨生長微環(huán)境中的生長和分化因子

現(xiàn)階段對于骨軟骨損傷修復(fù)的研究主要集中在：支架材料的構(gòu)建、種子細(xì)胞培育及篩選、軟骨生長微環(huán)境的調(diào)控三個方面。生長和分化因子是組織工程應(yīng)用中的重要部分，一些生長和分化因子已被確定參與調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育和成熟。生長因子是刺激成分，有助于軟骨發(fā)育和軟骨細(xì)胞表型的維持，通常用于誘導(dǎo)、加速或增強(qiáng)軟骨組織的形成。轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族信號在MSCs的分化中起關(guān)鍵作用［6］，但TGF-β在小鼠或兔動物體內(nèi)過度表達(dá)，已經(jīng)顯示出許多不良反應(yīng)，如導(dǎo)致局部骨贅形成、腫脹、滑膜增生，纖維化和吸引炎性細(xì)胞聚集到滑膜內(nèi)層的等［7］。這些結(jié)果說明需要協(xié)調(diào)TGF-β的使用來控制軟骨形成。研究最成熟的應(yīng)該是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），BMPS是一個比較大的亞族，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種BMP被提取克隆出來，他們在軟骨形成和成骨過程中發(fā)揮著重要作用。BMPs中，BMP-2、-4、-6、-7、-13、-14等具有增強(qiáng)軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和聚蛋白多聚糖的作用，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化的功能，目前仍沒有在人體中進(jìn)行臨床研究，驗證其增強(qiáng)軟骨修復(fù)的潛力，其局限性在于BMPs植入異位區(qū)時，會導(dǎo)致軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生，這是在軟骨組織工程中需要避免的［8］。成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族由22種結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白組成，他們分別與4種酪氨酸激酶FGF受體（FGFR）中的其中一種結(jié)合，在成體細(xì)胞中，F(xiàn)GF對軟骨的作用已經(jīng)引起較多的關(guān)注，在軟骨細(xì)胞周圍的基質(zhì)中天然存在豐富的FGF-2（也被稱為basic FGF，bFGF）），在三維培養(yǎng)中添加FGF-2，能明顯促進(jìn)聚蛋白多聚糖的合成和骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，有研究發(fā)現(xiàn)與高劑量的FGF-2相比，低劑量的FGF-2更能改善兔骨軟骨損傷的愈合，這個結(jié)果表明，F(xiàn)GFs的劑量可能與產(chǎn)生的效應(yīng)是相反的［9］。前期我們研究了體外單層兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的實驗，觀察添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）與透明質(zhì)酸（HA）對兔軟骨細(xì)胞的增殖影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF在10 ng/mL即可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，當(dāng)bFGF濃度增至50 ng/mL，其促進(jìn)作用達(dá)到最大值；單純使用HA并不促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖；當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用bFGF與HA時，在適宜濃度下可出現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)作用。說明bFGF明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，HA可以維持軟骨細(xì)胞的正常生長而不影響細(xì)胞的增殖，與bFGF聯(lián)合應(yīng)用時，更利于細(xì)胞生長［10］。此外，有研究顯示，F(xiàn)GF-2和-18預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠產(chǎn)生促進(jìn)修復(fù)軟骨組織缺陷的間充質(zhì)干細(xì)胞譜系［11］。這說明理解并加以利用FGFs信號通路對軟骨組織工程的發(fā)展有著重要作用。胰島素生長因子（insulin growth factor，IGF）家族主要由兩種配體（IGF-1和IGF-2）、兩種細(xì)胞表面受體（IGF1R和IGF2R）、六種不同的IGF結(jié)合蛋白（IGFBP-1至IGFBP-6）和多個IGFBP蛋白酶組成，這有助于調(diào)節(jié)多個組織中的IGF活性。在人類和小鼠中，IGF-1和IGF-2的突變會導(dǎo)致發(fā)育缺陷和智力遲鈍［12］。這提示IGF對細(xì)胞增長和發(fā)展的重要性。IGF-1具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活和增殖，誘導(dǎo)軟骨分化，促進(jìn)聚蛋白多聚糖合成等功能是軟骨穩(wěn)態(tài)和代謝的重要中介［13］。不同劑量的IGF-1在修復(fù)全層關(guān)節(jié)缺損期間誘導(dǎo)軟骨或軟骨下骨有不同的反應(yīng)：高劑量的IGF-1對新軟骨的形成和整合更有利，而低劑量的IGF-1對軟骨下骨形成更有效［14］。

3 軟骨損傷與氧化應(yīng)激

在促使OA的發(fā)病的諸多誘因中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）占有重要的位置，ROS可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡、滑膜炎癥和軟骨下骨的功能障礙［15］。過氧化氫酶（Catalase）是幾乎所有暴露于氧氣的生物體（如細(xì)菌，植物和動物）中最常見的酶，它能催化過氧化氫分解為水和氧氣，所以Catalase是保護(hù)細(xì)胞免受ROS氧化損傷的非常重要的酶［16］。氧化損傷涉及許多疾病狀態(tài)，包括炎癥性疾病，缺血和再灌注疾病，神經(jīng)退行性疾病和癌癥，以及細(xì)胞信號傳導(dǎo)和免疫［15］。在促使OA發(fā)病的諸多誘因中，ROS起到重要的作用，它能影響細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，促使軟骨細(xì)胞衰老、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡、滑膜炎癥和軟骨下骨的功能障礙［15］。探討復(fù)雜的氧化應(yīng)激信號傳導(dǎo)途徑是探索治療OA的潛在方法的一個選項。

Catalase對IL-1β的作用引人注目，IL-1β在OA發(fā)病中有重要作用，IL-1β與IL-1受體1（IL-1R1）結(jié)合后能夠增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，激活PKC、p38、ERK1/2、JNK、核因子-κB（NF-κB）、轉(zhuǎn)錄因子（ATF）和激活蛋白1（AP1）等炎癥信號［17］。IL-1β的天然拮抗劑IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）和2型IL-1誘餌受體（IL-1RII），可以結(jié)合IL-1β并阻斷其信號傳導(dǎo)，現(xiàn)已作為治療OA的藥物進(jìn)行臨床前試驗。IL-1β由前體pro-IL-1β而來，后者須經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酶Caspase-1切割，缺乏Caspase-1的動物沒有成熟的IL-Iβ。Pro-Caspase-1是NLRP3炎癥小體的一部分，NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，復(fù)合物形成后Pro-Caspase-1即被切割為成熟的Caspase-1，即炎癥小體激活。Caspase-1激活后可促進(jìn)IL-1β的活化表達(dá)［18］。在很多的動物模型中已經(jīng)證實：Caspase-1和Pro-IL-1β的激活是ROS依賴性的。據(jù)報道，幾種NLRP3活化劑如ATP，二氧化硅和石棉引發(fā)ROS產(chǎn)生，并且使用ROS清除劑抑制其阻止NLRP3活化。在NLRP3參與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程已經(jīng)明確［19］，但其是否參與OA的發(fā)病尚未可知［20］。2012年BOUGAULT等［21］發(fā)現(xiàn)在人類與小鼠壓力誘導(dǎo)的OA發(fā)病過程中，并不依賴NLRP3的激活途徑。但2018年MCALLISTER等［20］認(rèn)為NLRP3是一個潛在的OA疾病生化指標(biāo)，參與了OA的發(fā)病過程。

4 基因治療技術(shù)在軟骨損傷中的應(yīng)用

許多生物制劑的半衰期較短，難以在維持有效濃度的情況下長期作用于軟骨缺損部位，從而限制了其體內(nèi)療效。將目的基因轉(zhuǎn)移的基因治療技術(shù)已經(jīng)成為臨床治療的一個重要手段，它將目的基因產(chǎn)物在損傷或缺陷部位的細(xì)胞中表達(dá)，利用這些基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，細(xì)胞在局部合成目的蛋白質(zhì)并釋放到周圍微環(huán)境中［22］。在軟骨修復(fù)中，滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞是靶向基因修飾的三種主要細(xì)胞選擇類型。最近有報道基因療法在鐮狀細(xì)胞病［23］、血友?。?4］中都取得了肯定的療效，也許我們可以通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)賦予有利軟骨細(xì)胞功能的基因，例如調(diào)節(jié)炎癥和賦予細(xì)胞長壽，或持續(xù)表達(dá)透明軟骨表型、生產(chǎn)Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖等。如VERMEIJ等［25］在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中表達(dá)了炎癥依賴性啟動子控制下的抗炎白細(xì)胞介素-10（IL-10）基因取得了良好的療效。GRIFFIN等［26］使用IGF-I基因增強(qiáng)的軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)械特性和結(jié)構(gòu)得到了理想的效果。再者GONZALEZ-FERNANDEZ等［27］通過基因療法將富含TGF-β3和BMP2髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合藻酸鹽水凝膠用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的組織工程也具有良好的可行性。STONE等［28］通過組合Prg4和Il-1ra基因成功預(yù)防小鼠創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎中的痛覺過敏和軟骨退化。基因傳遞的應(yīng)用最關(guān)鍵是需要載體的幫助，載體能有效地將目的cDNA傳遞給目的細(xì)胞，并為所需的生物反應(yīng)提供合適的轉(zhuǎn)基因表達(dá)時間。我們曾利用慢病毒載體針對軟骨細(xì)胞的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾。采用由載體質(zhì)粒pLentiLox3.7、包裝質(zhì)粒pRSV-REV、pMDLg/pRRE及包膜質(zhì)粒VSV-G等組成的四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)，四質(zhì)粒系統(tǒng)可以使各質(zhì)粒之間的共同重疊序列最小化，盡量減少共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒的可能，提高了病毒載體的生物安全性，觀察到綠色熒光蛋白基因表達(dá)的細(xì)胞達(dá)到80%以上，說明慢病毒載體能夠高效感染，并實現(xiàn)目的基因的有效表達(dá)，有望成為軟骨組織工程中理想的基因運(yùn)載工具。因此，體外基因傳遞作為讓種子細(xì)胞支架復(fù)合物過表達(dá)和釋放目的蛋白到局部的一種轉(zhuǎn)移方法，越來越受到關(guān)注。

5 展望

深入探討軟骨修復(fù)微環(huán)境中生長和分化因子，及對ROS的有效調(diào)控，將收獲良好的應(yīng)用前景。基因治療是未來治療OA的方向，不過還存在一些需要解決的問題。如基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后生長因子的濃度可能超過預(yù)期，產(chǎn)生生物毒性；轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持續(xù)時間；臨床相關(guān)的動物模型；體外轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相對于直接基因轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)勢以及為每個特定的臨床問題確定最佳的治療因子［29-30］。因此，體外基因傳遞作為一種讓種子細(xì)胞支架復(fù)合物過表達(dá)和釋放目的蛋白到局部的轉(zhuǎn)移方法，對軟骨修復(fù)有很大的前景，但仍處于起步階段。