犬圓環(huán)病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查

張渝菡

（漯河市召陵區(qū)畜牧局，河南漯河 462000）

1 犬圓環(huán)病毒大的發(fā)現(xiàn)

在2012年之前，豬圓環(huán)病毒是唯一報道的感染哺乳動物的圓環(huán)病毒。其中圓環(huán)2病毒可以引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥，豬皮炎和腎病。2012年，國外學(xué)者Kapoor等人通過高通量測序技術(shù)從犬的血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型的圓環(huán)病毒，并將其命名為犬圓環(huán)病毒。隨后，在意大利和我國，學(xué)者們在犬體內(nèi)均分離到了犬圓環(huán)病毒病并獲得該病毒的全基因序列。2017年，國際病毒分類委員會在報道中將其歸為圓環(huán)病毒屬，并命名為Canine circovirus。

2 犬圓環(huán)病毒的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)

犬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬還包括豬圓環(huán)病毒2型，鴨圓環(huán)病毒、鵝圓環(huán)病毒、金絲雀圓環(huán)病毒、禽白血病病毒等。因此犬圓環(huán)病毒也沒有囊膜，屬于單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小約為2063nt，比圓環(huán)病毒2的基因多276～277nt。犬圓環(huán)病毒有至少兩個開放閱讀框，ORF1開放閱讀框相對比較保守一些，ORF2變異程度相對比較大。ORF1開放閱讀框有912個堿基，編碼犬圓環(huán)病毒的復(fù)制酶，與該病毒的復(fù)制有關(guān)。第二個開放閱讀框主要編碼衣殼蛋白。

3 犬圓環(huán)病毒的基因結(jié)構(gòu)

犬圓環(huán)病毒的基因組長度約為2063nt，比圓環(huán)病毒1型多304nt，比圓環(huán)病毒2型多276～277nt，比圓環(huán)病毒3型多63nt。犬圓環(huán)病毒主要有兩個開放閱讀框，這兩個開放閱讀框起始密碼子之間的5’端非編碼區(qū)長為135nt，并且有保守的非核酸序列TAGTATTAC，這和鳥類和豬圓環(huán)病毒的共有序列相似，并且有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在兩個開放閱讀框的終止密碼子的3’端非編碼區(qū)域有203nt。圓環(huán)病毒2型基因組還有一個編碼的蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4 流行情況

自從美國首次在犬血清中檢測到圓環(huán)病毒后，犬血清中的圓環(huán)病毒檢出率高達2.9%。次年，同樣在美國，國外學(xué)者在患病犬肝臟中分離出犬圓環(huán)病毒，并初步鄭密昂犬圓環(huán)病毒的發(fā)作與犬感染其他病有關(guān)[1]。2014年意大利學(xué)者在6只臘腸犬的胃腸道中發(fā)現(xiàn)了犬圓環(huán)病毒，并得出此次臘腸犬爆發(fā)急性胃腸炎很可能與犬圓環(huán)病毒的感染有關(guān)。國外學(xué)者在對2009年到2013年收集的32份狐貍血清樣品中發(fā)現(xiàn)了一種圓環(huán)病毒，并且圓環(huán)病毒的檢出率非常高，高達62.5%，經(jīng)過進化樹分析發(fā)現(xiàn)該病毒與犬圓環(huán)病毒的同源性高達89%。2016年我國學(xué)者首次在大陸從犬血清中檢測到犬圓環(huán)病毒，經(jīng)過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，我國發(fā)現(xiàn)的犬圓環(huán)病毒與歐美各國發(fā)現(xiàn)的賭注屬于不同的進化分枝。

5 致病性和臨床癥狀

研究表明，犬圓環(huán)病毒主要與犬出血性腹瀉、壞死性血管炎有關(guān)系，病毒主要存在于腸道內(nèi)部，有的還存在于肝臟、脾臟和淋巴等組織內(nèi)部。另外，犬圓環(huán)病毒有可能是淋巴結(jié)肉芽腫的致病因子。犬圓環(huán)病毒的臨床癥狀與圓環(huán)2型引起的豬的皮炎與腎病綜合征在臨床癥狀和病理變化上都非常相似。

6 檢測方法

6.1 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)是用已知堿基序列并帶有標(biāo)志物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待檢測的核酸按照堿基互補配對原則特異性結(jié)合形成雜交體，在通過與標(biāo)志物相對應(yīng)的檢測體系去檢測，通過顯微鏡觀察便可以看到雜交信號并且可以在顯微鏡下對靶基因進行定位。

6.2 熒光定量PCR技術(shù)

國外學(xué)者對犬圓環(huán)病毒分別建立了Replicate 和Capsid基因的熒光定量探針方法，也有學(xué)者根據(jù)犬圓環(huán)病毒NY21基因的序列設(shè)計引物并建立了SYBR Green熒光定量檢測方法。熒光定量檢測方法快速，簡便，靈敏度非常高，在臨床上和日常檢測中很常用。

6.3 常規(guī)PCR方法

PCR方法是檢測病毒和細(xì)菌常用的檢測方法之一，PCR方法以其快速、簡便、特異性強等特點，在犬圓環(huán)病毒檢測中應(yīng)用非常廣泛。國外學(xué)者Gentil等根據(jù)犬圓環(huán)病毒的基因序列設(shè)計出了特異性引物進行PCR方法檢測，結(jié)果表明，在患有腹瀉的犬中犬圓環(huán)病毒的檢出率達到20.1%，健康組的犬中，犬圓環(huán)病毒的檢出率只有7.3%。

6.4 多重PCR方法

多重PCR是一種特殊的PCR檢測技術(shù)，其原理是在同一反應(yīng)管中加入多對引物，可以同時檢測兩種以上的病種，從而達到特異性檢測犬圓環(huán)病毒的目的。這種方法快速，簡便，靈敏，在臨床上和實際工作中應(yīng)用非常廣泛。

6.5 病毒的分離鑒定

將病死的犬組織進行研磨，并反復(fù)凍融3次，之后8000rpm離心15min，取上清，將上清用無菌過濾器過濾后接種于細(xì)胞，3d后，取細(xì)胞培養(yǎng)物，用間接免疫熒光方法或者PCR方法即可檢測出犬圓環(huán)病毒。

6.6 間接免疫熒光

間接免疫熒光方法主要是利用已知的犬圓環(huán)病毒抗原來檢測待檢血清中的抗體以及病變組織和犬圓環(huán)病毒感染情況。這種檢測方法成本較低，且簡單快捷。但是實際操作非常復(fù)雜，不適合臨床檢測。

6.7 免疫組織化學(xué)方法

免疫組織化學(xué)方法和間接免疫方法一樣，是一種免疫染色方法，其原理是抗原抗體結(jié)合后，利用酶細(xì)胞化學(xué)的一種手段檢測抗原抗體復(fù)合物的一門新的技術(shù)。免疫組織化學(xué)方法可以對攜帶的抗原的細(xì)胞或者組織的形態(tài)進行大體的評價，而且只需要普通的顯微鏡就可以觀察出來，且顏色穩(wěn)定，樣品也容易保存起來。