湯陰北艾精油及其主要成分對對乙酰氨基酚誘導小鼠肝損傷的保護作用

曹瑞敏 米克熱木·沙衣布扎提 陳保君 張守泉 蔣志惠* 張小鶯，*

（1.動物醫(yī)學學院，新疆農(nóng)業(yè)大學，新疆烏魯木齊 830052；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應用國際聯(lián)合實驗室，安陽工學院，河南安陽 455000；3.湯陰醫(yī)藥開發(fā)辦公室，河南安陽 456150）

艾屬菊科（Asteraceae）蒿屬（Artemisia），是多年生草本或略成半灌木狀宿根草本植物，植株有濃烈香氣，廣泛分布于亞高山地區(qū)草原[1]。北艾產(chǎn)自河南省安陽市湯陰縣，是中國“四大名艾之首”。湯陰北艾之九頭仙艾因扁鵲而得名，戰(zhàn)國時期扁鵲在魏國湯陰邑一帶行醫(yī)，常用九頭仙艾治病，北艾精油是北艾主要成分[2]。北艾以葉入藥，主要活性成分有1，8-桉葉素、倍半萜烯醇及其酯等[3]，其中1，8桉油精具有抗氧化的作用[4]。該類植物的提取物具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝聚、抑制NO生成、鈣拮抗等活性作用[5]。因艾草藥用功能顯著且價格低廉，其在藥用和保健上的關注度逐年上升。

對乙酰氨基酚（N-acetyl-para-aminophenol，APAP），是一種廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上常用于治療感冒引起的發(fā)熱和緩解輕疼痛[6]。APAP能迅速被腸道吸收并在肝臟內代謝，APAP安全劑量下療效確切，用藥可靠，大多數(shù)（85%-90%）由UDP-葡萄醛酸基轉移酶和磺基轉移酶催化，有10%的APAP通過細胞色素P-450酶代謝，特別是CYP2E1亞型酶代謝產(chǎn)生具有毒性的中間體N-乙酰基對苯醌亞胺（NAPQI）[7，8]。NF-κB是炎癥的主要調節(jié)因子，NF-κB的激活與炎癥反應強烈相關[9]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細胞因子，在多種疾病的發(fā)病機制中起著重要的作用。大多數(shù)TNF-α基因多態(tài)性位于啟動子地區(qū)，并且它們被認為是影響人類不同疾病的易感性和嚴重程度[10]。APAP誘導的肝功能異常除了與肝細胞線粒體結構變化以及氧化應激反應等有著緊密關系[11]。

北艾精油和1，8桉油精具有抗氧化、抑制炎癥的作用，推測其具有潛在治療藥物性肝損傷的作用。為證明這一假設，我們利用APAP誘導的大鼠肝損傷模型，研究艾草精油及其主要成分1，8桉油精對肝臟損傷的保護作用及其機制，為北艾后續(xù)的研究提供數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

實驗昆明小鼠購于鄭州大學實驗動物中心，體質為20～25g。

1.2 主要試劑

北艾采自河南省安陽市湯陰縣扁鵲廟，采摘時間為2018年5月；總mRNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒、SYBR@Green Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

氣相色譜與質譜聯(lián)用儀（5977A-MSD）購自美國安捷倫科技有限公司、實時熒光定量PCR （2720）購自Life Technologies有限公司、超高速離心機（5810R）購自上海艾研生物科技有限公司、光學顯微鏡（BX53）購自日本Olympus精密儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 北艾提取物的制備與鑒定

2.1.1 北艾精油的提取

艾葉經(jīng)過自然晾干后粉碎，稱取60 g艾絨溶于0.6 L蒸餾水中，95℃加熱2 h，分離下層艾露，收集上層精油，重復3次。

2.1.2 北艾精油成分的鑒定

氣相色譜條件為：H P-5 m s非極性毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為氦氣，流量10 mL/min，進樣量2μl，初始溫度70℃，采用程序升溫以10℃/min速率升溫至95℃，以5℃/min速率升溫到125℃，以6℃/min速率升溫到180°C，以20℃/min速率升溫到280℃，分流比15∶1。

質譜分析條件為：離子源為EI，電離電壓70eV，進樣口溫度200℃，離子源溫度230℃，掃描范圍30～600amu。

取上述揮發(fā)油10μL置進樣瓶中，用甘油定容至10ml。按照“1.2.2色譜質譜條件”對艾草揮發(fā)油進行GC-MS分析，將分辨質譜數(shù)據(jù)與Demo、Nilt08譜庫進行成分比對。

2.2 給藥處理及分組

昆明小鼠，體重18～25g，動物飼養(yǎng)于恒溫環(huán)境，自由進食。按隨機分組原則將30只小鼠隨機分為6組，每組5只，藥物組提前0.5h給于APAP。分別為正常對照組（NC），APAP模型組（300mg/kg），N-乙酰-L-半胱氨酸陽性對照組（100mg/kg，NAC），APAP+北艾精油（100mg/kg，0.1%吐溫80，APAP+EOs）組，APAP+1，8桉油精（28mg/kg，0.1%吐溫80，APAP+1，8）組以及1，8桉油精對照組（28mg/kg，0.1%吐溫80，1，8）。NAC組及各實驗組按300mg/kg體重腹腔注射APAP，NC組腹腔注射相同體積的生理鹽水。每組連續(xù)給藥3d，給藥間隔為8h。最后一次注射藥物24h后，脫頸致死摘除小鼠肝臟，用0.9%生理鹽水洗滌表面的血污，剪取肝臟部分右葉固定于4%甲醛固定液中，待24h后進行組織病理切片制備及形態(tài)學分析。剩余肝臟分裝，-80℃保存，備用。

2.3 組織切片的制作與觀察

剪取由4%甲醛固定液中的肝組織進行脫水透明、石蠟包埋，靜置6～h，切片（5nm）后貼片放入37℃烘箱過夜，脫蠟，最后用蘇木精和伊紅（H&E）染色，封片鏡檢。

2.4 相關炎癥因子mRNA的表達

根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書進行樣品提取，在260nm和280nm吸光度下檢測RNA吸光度，符合兩者比值1.8～2.0之間，使其濃度調節(jié)至1mg/L，取mRNA1μg進行cDNA反轉錄，將cDNA分裝存放-80℃保存，備用。取cDNA反轉錄產(chǎn)物2μl，使用特異性引物直接擴增特異性cDNA（表1）。實時熒光定量q-PCR在QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System上使用SYBR?GreenMaster Mix檢測。以β-actin作為內參，帶入公式2-（ΔΔCt）將mRNA的目的基因與對照基因為相對表達的比率。

表1 cDNA片段實時熒光定量擴增引物Fig.1 The q-PCR primer of cDNA fragment

3 結果

3.1 北艾精油成分

采用GC-MS法分析北艾精油成分。各成分的質子總離子圖如圖1所示。從北艾精油中鑒定出各色譜峰的化學成分，除溶劑以外的全部峰面積作為100%，同時采用色譜峰面積歸一化法計算出各成分的相對百分含量（表2）。結果顯示，從北艾中共檢測出15種化學成分，主要包括黃酮類、半萜類等，主要成分有1，8桉油精、龍腦、α-水芹烯和萜品油烯等，各占5.9%、11.4%、24.9%、11.0%和14.6%。

3.2 北艾精油和1，8桉油精緩解肝組織病變

1，8桉油精和正常對照組的肝細胞以中央靜脈為軸心呈放射狀，排列整齊，出現(xiàn)多細胞核（圖2A，F(xiàn)）；APAP處理后引起嚴重肝細胞損傷，表現(xiàn)為肝細胞大量壞死、中心性腦泡變性和淋巴細胞浸潤（圖2B）。在APAP-EOs組中，小葉區(qū)肝細胞的一小部分表現(xiàn)為細胞質空泡，較APAP組壞死細胞明顯減少，肝損傷明顯減輕（圖2D），1，8桉油精與NAC組（圖2C，D）相似，與APAP組肝損傷相比有明顯的區(qū)別。表明北艾精油和1，8桉油精能夠緩解APAP引起的肝毒性病理變化，對肝損傷有明顯的治療作用。

圖1 北艾水提取的總離子流色譜圖

圖2 北艾精油和1，8桉油精對APAP誘導的肝臟組織病理學變化

3.3 北艾精油和1，8桉油精抑制炎癥相關因子的表達

與正常對照組比較，APAP處理后小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、CXCL-1、STAT-3、TLR-4、VCAM-1和NF-κB水平顯著升高（p ＜ 0.05，圖3）。經(jīng)北艾精油及其主要成分1，8桉油精分別治療后，發(fā)現(xiàn)基因的表達水平均較APAP模型組下降。其中TNF-α、IFN-γ和TLR-4顯著下降，分別為1.59，1.78；1.95，1.68；2.55和1.92倍。

圖3 北艾精油和1，8桉油精對炎癥相關因子mRNA表達的影響

4 討論

在菊科蒿屬植物中，北艾具有非常重要的藥用價值并且作為藥物有著很長的歷史[12]。本研究通過水蒸餾法提取出來的北艾精油得率為0.3%，采用GC-MS分析，鑒定出主要活性成分中1，8桉油精在北艾精油中相對百分含量為5.9%。

藥物性肝損傷是引起急性肝功能衰竭的主要原因，其中APAP是最常見的誘導劑[13]。APAP過量（300mg/mL）可引起小鼠嚴重的肝毒性，APAP中毒時，II期偶聯(lián)酶飽和，較高的部分轉化為NAPQI，導致氧化應激和肝細胞壞死[14]。HE染色結果表明，APAP小鼠肝細胞出現(xiàn)嚴重的病理改變，如排列疏松、空泡變性、壞死明顯（圖2B），同時炎癥因子以及趨化因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3CXCL-1、TLR-4、VCAM-1和NF-κB表達顯著增加，表明APAP肝損傷模型構建成功。

表2 北艾精油主要成分的GC-MS分析結果

在給予北艾精油和1，8桉油精治療后，肝臟細胞形態(tài)恢復正常，細胞壞死現(xiàn)象明顯得到緩解（圖2）。Toll樣受體（Tolllike receptors，TLR）是作為連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR4能識別外源性的病原體或識別內源性物質及產(chǎn)物，可激發(fā)NF-κB等一系列信號通路，并且上調促炎因子、趨化因子的釋放[15]。本實驗結果表明APAP過量的情況下NF-κB的表達顯著增加，組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、STAT-3以及趨化因子CXCL-1和VCAM-1的表達也增加。經(jīng)北艾精油及其1，8桉油精治療后，其可下調TNF-α、TLR-4等基因的表達。說明北艾精油及其1，8桉油精可以抑制炎癥因子的分泌，減少APAP引起的肝臟損傷，提示北艾精油及其1，8桉油精可能通過抑制炎癥因子的表達進而緩解肝臟損傷。

5 結論

北艾精油及從其鑒定出的主要成分1，8桉油精具有顯著的緩解肝損傷和抗炎作用，能有效治療過量APAP誘導的肝細胞壞死和肝毒性。