非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測的污染控制

盛 敏

(河南省動物疫病預(yù)防控制中心,河南鄭州 450000)

1 設(shè)施環(huán)境

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室只做熒光PCR方法時，應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域：試劑準(zhǔn)備室、核酸提取室、擴(kuò)增分析室。試劑準(zhǔn)備室用于貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制，以及離心管、Tip頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。核酸提取室用于樣品處理、核酸提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。樣品處理應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。擴(kuò)增分析室用于DNA擴(kuò)增及檢測分析。這3個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，在使用中也始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣直接相通。為防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域，造成污染，實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)按照試劑準(zhǔn)備室→核酸提取室→擴(kuò)增分析室進(jìn)行。按照從試劑準(zhǔn)備室→核酸提取室→擴(kuò)增分析室方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行。可通過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行的方式實(shí)現(xiàn)。

2 樣品

用于非洲豬瘟檢測的樣品是具有潛在傳染危險性的材料，進(jìn)行剪碎、研磨、離心及滅活處理時應(yīng)在二級生物安全柜中進(jìn)行，勿使液體濺到生物安全柜中，避免樣品間交叉污染。裝有樣品的離心管一定要蓋嚴(yán)，避免由于密封不嚴(yán)溢于容器外或容器外粘有樣品而造成相互間交叉污染。

3 儀器

在試驗(yàn)中用到的主要儀器有熒光PCR 儀、冷凍離心機(jī)、二生物安全柜、核酸提取儀、微量移液器等，要對這些儀器定期進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)或功能性檢查，確保儀器處于正常工作狀態(tài)。要保持熒光PCR 儀的清潔衛(wèi)生，避免儀器內(nèi)部被熒光物質(zhì)污染。試劑準(zhǔn)備室和核酸提取室都要有一套完整移液器（覆蓋0.2～1000μl），互相不能調(diào)換使用。

4 試劑

使用市售商品化試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，在收到試劑盒后應(yīng)將盒內(nèi)的陽性對照放置于核酸提取室，將熒光PCR預(yù)混液放置于試劑準(zhǔn)備室。試劑盒中的陽性對照大多是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，在開蓋吸取的時候一定要小心，一旦濺灑，污染樣品的可能性很大。

5 人員

檢測人員要具備良好的防污染意識和操作技能，到不同的區(qū)域時，要注意及時更換防護(hù)用品。在核酸提取室操作時，戴的一次性手套、口罩、帽子要勤換，避免污染。要帶新的一次性PE手套對熒光 PCR管封蓋，避免徒手或用過的手套接觸熒光 PCR 管，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)的一次性手套。為避免污染，實(shí)驗(yàn)室在人員管理上要實(shí)行考核上崗和定期培訓(xùn)制度，檢測人員要培訓(xùn)考核合格后才能上崗。

6 試驗(yàn)

6.1 基本原則

進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑準(zhǔn)備室→核酸提取室→擴(kuò)增分析室。各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。建議不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（用顏色區(qū)分）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑準(zhǔn)備室→核酸提取室→擴(kuò)增分析室的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

6.2 預(yù)混和分裝試劑

擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。一般會將熒光PCR預(yù)混液小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會。預(yù)混和分裝試劑時只能用試劑準(zhǔn)備室的移液器和 Tip頭，禁止用其他區(qū)域的移液器和Tip頭。

6.3 核酸提取加樣

要認(rèn)真按照試劑盒說明書或作業(yè)指導(dǎo)書步驟進(jìn)行，防止試劑和樣品受到氣溶膠的污染。操作時要戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，應(yīng)立即更換手套。開離心管時要用雙手，動作要輕緩，防止液體濺出[1]。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。用移液器吸取液體或加樣時要十分小心，吸取要慢，吸取時盡量一次性完成，不要多次抽吸，如果有條件，可使用帶濾芯的Tip頭，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。加樣時最后加陽性對照，減少陰性對照和樣品被污染的概率。為避免樣品間的交叉污染，加入待測核酸后，應(yīng)立刻蓋緊管蓋。

6.4 擴(kuò)增分析

在擴(kuò)增分析室要盡量減少走動，以避免氣溶膠所致的污染。因?yàn)闊晒釶CR擴(kuò)增后不需要電泳，擴(kuò)增后的反應(yīng)管嚴(yán)禁打開，直接進(jìn)行無害化處理。

6.5 清潔

試驗(yàn)結(jié)束后，必須立即對工作區(qū)進(jìn)行清潔。通常采用次氯酸鈉或紫外照射對工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面進(jìn)行消毒清潔。次氯酸鈉具有氧化損傷核酸的作用，從而使可能留在實(shí)驗(yàn)臺面核酸被破壞掉。通常使用10%的次氯酸鈉擦洗實(shí)驗(yàn)室，然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸鈉。紫外照射非常方便有效，其去污效果取決于紫外照射的距離和能量。一般將可移動紫外燈（254nm波長）調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上60～90cm內(nèi)照射。由于熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對，對紫外線損傷敏感度低，因此最好是照射過夜。