SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在蘋果種質(zhì)資源及遺傳育種研究中的應(yīng)用

侯麗媛，董艷輝，張春芬，肖 蓉，鄧 舒，聶園軍，趙 菁，曹秋芬

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006）

蘋 果（Malus dom estica Borkh.） 屬 薔 薇 科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae） 蘋果屬（Malus Mill.）植物，是世界上最重要的果樹之一。世界蘋果屬植物資源約35 個種，廣泛分布于亞洲、歐洲和北美洲；而我國是世界蘋果屬植物最大的起源中心之一，原產(chǎn)我國的有27 種之多，其中，野生近緣種21 種，栽培或半栽培種6 種[1-2]。

簡單重復(fù)序列（SSR）是普遍存在且隨機(jī)分布于真核生物基因組中的一種特殊序列，主要由串聯(lián)重復(fù)單元組成，其核心單位由1～6 個核苷酸組成。SSR 標(biāo)記具有高度重復(fù)性、豐富的多態(tài)性、共顯性、高度可靠性以及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是近年來獲得廣泛應(yīng)用的一類特異性強(qiáng)的分子標(biāo)記。目前，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在蘋果研究中得到廣泛應(yīng)用，主要在種質(zhì)資源的鑒定、重要農(nóng)藝性狀的基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面發(fā)揮了極大作用。筆者就SSR 標(biāo)記技術(shù)近年來在蘋果種質(zhì)資源及遺傳育種中的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為蘋果遺傳育種研究提供參考。

1 品種鑒定中的應(yīng)用

蘋果栽培歷史悠久，種間易于雜交，無性繁殖容易，加之不同地域間的種質(zhì)交流頻繁，導(dǎo)致種質(zhì)混亂，同名異種或同種異名現(xiàn)象普遍，既不利于標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用和品種優(yōu)良特性的發(fā)揮，也不利于國際交流與貿(mào)易的正常開展。蘋果種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定是種質(zhì)資源利用和保存的前提。目前，SSR 分子標(biāo)記已被公認(rèn)為植物品種鑒定應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記體系，在蘋果品種資源鑒定中也得到了大量的應(yīng)用。

早在1997 年，GUILFORD 等[3]利用蘋果基因組文庫GA 重復(fù)序列，首次開發(fā)設(shè)計了蘋果的14 對SSR 引物，對21 個蘋果栽培品種進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)其中3 對高度多態(tài)引物，并且僅用1 對引物23g4 就對9 個品種進(jìn)行了區(qū)分。GIANFRANCESCHI 等[4]開發(fā)了16 對新的蘋果SSR 引物，對21 個品種進(jìn)行鑒定，并且利用其中的2 對引物就能區(qū)分這些品種。LUíS 等[5]用SSR 和ISSR 標(biāo)記將41 個蘋果品種中除芽變之外的品種進(jìn)行了區(qū)分。宣繼萍等[6]以7 個蘋果品種為試材，構(gòu)建了蘋果ISSR 指紋圖譜。COART 等[7]采用SSR 和AFLP 標(biāo)記相結(jié)合，將歐洲野生森林蘋果與栽培蘋果品種基本區(qū)分開來。除了一個突變體品種外，其余蘋果基因型僅用4 對引物就可以完全區(qū)分。王愛德等[8]用2 對SSR 引物GD142 和02b1，對25 個蘋果品種進(jìn)行了區(qū)分。蔡青等[9]在45 個蘋果品種中篩選出10 對SSR 引物，共擴(kuò)增出94 個位點(diǎn)，平均每對引物有9.4 個擴(kuò)增位點(diǎn)，并用其中的3 對引物NZ02b1，GD12，GD162對這45 個品種進(jìn)行了鑒別。VAN TREUREN 等[10]用16 對SSR 標(biāo)記，對695 份種質(zhì)中的45 個品種的登記名進(jìn)行了糾正；此后，高華等[11]利用SSR 分子標(biāo)記對蘋果栽培品種進(jìn)行鑒定，用3 對引物（Hi01c11，Hi03d06 和GD162）將供試的40 個蘋果栽培品種進(jìn)行鑒定分類。FORONI 等[12]在對亞速爾群島采集到的200 個蘋果栽培品種進(jìn)行SSR 分析后，發(fā)現(xiàn)這些樣品具有高度變異性，并最終鑒別出60 個異名同物和32 個同名異物。LARSEN 等[13]用15 對SSR 標(biāo)記，對448 個蘋果的栽培品種基因分型，共擴(kuò)增出284 個等位基因，其中有42 個品種各擴(kuò)增出1 個等位基因，其標(biāo)記擴(kuò)增的位點(diǎn)可以用來區(qū)分這42 個品種。

TP-M13-SSR 技術(shù)是在SSR 分子標(biāo)記技術(shù)與熒光自動測序技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展形成的對SSR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光測序的檢測體系。分子身份證是在得到DNA 指紋圖譜的基礎(chǔ)上得到的，可以快速實現(xiàn)分子鑒定。從2010 年開始，高源等[14]應(yīng)用TP-M13-SSR 技術(shù)對原產(chǎn)我國的蘋果屬植物、部分蘋果種質(zhì)資源及部分栽培品種進(jìn)行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上獲得了每份測試材料的獨(dú)有的分子身份證；2015 年，高源等[15]對我國原產(chǎn)蘋果屬植物27 份材料構(gòu)建了12 個SSR 位點(diǎn)的指紋圖譜，并運(yùn)用條形碼技術(shù)生成了其分子身份證；以國家果樹種質(zhì)蘋果圃保持的蘋果地方品種、育成品種及其野生近緣種為試材，利用TP-M13-SSR 技術(shù)構(gòu)建了蘋果種質(zhì)分子身份證[16-17]。

諸多研究結(jié)果表明，在品種鑒定及品種保護(hù)權(quán)研究中，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)是可行的。

2 親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

遺傳多樣性是種質(zhì)資源評價的重要指標(biāo)，是指種內(nèi)不同種群之間或一個種群內(nèi)不同個體的遺傳變異，是物種適應(yīng)自然和發(fā)生進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)，也是遺傳育種的重要保證。蘋果屬種質(zhì)資源極為豐富，包括大量的野生種和栽培種。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)可以有效地對種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行研究，在這方面前人已做過許多研究。

2.1 遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

HOKANSON[18]利用8 對SSR 引物對蘋果屬23 個種以及一些種間雜種和栽培品種進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，栽培蘋果等位基因的雜合度明顯高于蘋果屬野生種以及種間雜種。GALLI 等[19]對66 個蘋果栽培品種用6 對SSR 標(biāo)記進(jìn)行了分子鑒定，共檢測到55 個等位基因，平均每個位點(diǎn)9.2 個等位基因，多態(tài)性信息含量平均為0.72。徐興興等[20]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對20 個主要蘋果栽培品種的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，共擴(kuò)增出163 個位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)74 個，每對引物的多態(tài)位點(diǎn)百分率為33.33%～63.16%。高源等[21]用SSR 標(biāo)記對59 份蘋果屬材料進(jìn)行多態(tài)性分析，從20 對引物中篩選出12 對SSR 引物，擴(kuò)增出176 個等位基因，平均每個位點(diǎn)14.7 個等位基因，位點(diǎn)雜合度為0.403 9～0.741 2，遺傳多樣性指數(shù)為0.615 6。只用其中的3 對引物即可區(qū)分全部供試材料，通過聚類分析將59 份蘋果屬材料分為三大類群，即栽培品種、地方品種和新疆的野生蘋果、野生種或其變種。FAR-ROKHI 等[22]對伊朗蘋果栽培品種和地方品種進(jìn)行遺傳多樣性的評估，在16 個SSR 位點(diǎn)生成45 個等位基因，多態(tài)性信息含量（PIC）0.18 ～0.76，其平均值為0.49。ZHANG 等[23]利用19 對SSR 分子標(biāo)記對29 個蘋果樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。FU 等[24]用10 對SSR 標(biāo)記對15 個同型小種的蘋果屬進(jìn)行了基因組多態(tài)性和遺傳關(guān)系分析，得出這些試驗材料的遺傳相似系數(shù)為0.53～0.88。2013 年，董研等[25]利用17 對SSR引物對新疆鞏留、新源、霍城、托里4 個居群下的12 個新疆野蘋果天然群體進(jìn)行了群體等位基因和基因型差異分析。

2.2 親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用

KENTARO 等[26]對8 個蘋果品種的親子代關(guān)系運(yùn)用SSR 引物和S-RNase 基因進(jìn)行了研究，用19 對SSR 引物對42 個蘋果品種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，同時，KITAHARA 等[27]結(jié)合等位基因鑒定了9 個蘋果品種的親本。宋燁等[28]利用12 對SSR標(biāo)記，對18 個蘋果加工品種和2 個鮮食品種進(jìn)行了遺傳差異和聚類分析。秦偉等[29]利用SSR 標(biāo)記技術(shù)對21 份新疆地區(qū)的蘋果種質(zhì)資源進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，若以遺傳相似系數(shù)0.63為閾值，可將這21 份地方資源聚類成3 組，且地方品種和野生品種交叉分布，說明了地方品種可能是由野生品種直接馴化而來，或是長期雜交或遺傳變異造成的。高華等[11]利用12 對SSR 引物對40 個蘋果栽培品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，這40 個蘋果品種的遺傳多樣性較高，其相似系數(shù)為0.705～0.982，在相似系數(shù)0.862 處被分為五大類群，這一研究結(jié)果與品種的系譜來源基本吻合。高源等[30]利用TP-M13-SSR 分析技術(shù)體系對25 份蘋果種質(zhì)資源的地方品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，得到遺傳多樣性、多態(tài)性信息含量和位點(diǎn)雜合度等多個信息，并利用UPGMA 法聚類分析將25 個蘋果品種分為二大類，揭示了其與地理起源和親緣關(guān)系相關(guān)。PATZAK 等[31]用微衛(wèi)星標(biāo)記對捷克蘋果品種進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳關(guān)系評估分析，將捷克蘋果品種分為3 個主要群組。李荷蓉等[32]利用ESTSSR 引物把22 個蘋果品種區(qū)分開，聚類分析后在遺傳相似系數(shù)為0.84 處，可以將全部蘋果品種分為8 個組。宋尚偉等[33]開發(fā)應(yīng)用16 對EST-SSR 引物，對蘋果品種資源的親緣關(guān)系進(jìn)行研究并聚類成樹狀圖，在相似性系數(shù)0.65 處，可將118 個供試材料分為五大組。李政等[34]以18 個新疆野蘋果優(yōu)系、23 個鮮食蘋果品種和7 個蘋果砧木品種為材料，對3 類蘋果資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并對不同SSR 引物的效率值進(jìn)行對比分析，同時應(yīng)用定位到17 條染色體的80 對SSR 引物對3 類蘋果進(jìn)行了分析。

以上研究結(jié)果表明，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確地對蘋果不同品系進(jìn)行遺傳多樣性評估，并通過聚類分析能夠反映出不同蘋果品種的品種特性、地域特性和親緣關(guān)系。

3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL 定位中的應(yīng)用

基因定位、克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)是利用分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜。由于蘋果生長周期長、高度雜合，因此，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜進(jìn)行經(jīng)濟(jì)性狀的標(biāo)記、定位以及相對基因的克隆具有更加重要的意義。

3.1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

HEMMAT 等[35]以Rome Beauty×White Angel 為作圖群體，綜合運(yùn)用RAPD，RFLP 以及同工酶標(biāo)記，構(gòu)建了第1 張含有360 個DNA 分子標(biāo)記的較為完整的蘋果遺傳圖譜。隨著SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，GIANFRANCESCHI 等[4]開發(fā)的10 個SSR 引物進(jìn)一步完善了蘋果的RAPD 遺傳圖譜。MAILEPAARD 等[36]利用包括SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在內(nèi)的多種標(biāo)記手段，用蘋果品種Prima×Fiesta 的F1群體的152 株植株為材料，構(gòu)建了雙親的遺傳連鎖圖，并將與Sd1，Ma，S 基因連鎖標(biāo)記在圖譜上進(jìn)行了定位，該圖譜具有較多共顯性標(biāo)記和較高的標(biāo)記密度，是蘋果理想的參考圖譜。LIEBHARD 等[37]構(gòu)建了Fiesta×Discovery 的遺傳連鎖圖，該圖譜具有115 個共顯性SSR 標(biāo)記，覆蓋了蘋果基因組17 條染色體。隨后，LIEBHARD 等[38]又對該圖譜做了進(jìn)一步整合，利用分布在17 條連鎖群上的129 個SSR 及其他分子標(biāo)記構(gòu)建了較為飽和的蘋果遺傳圖譜，該圖譜覆蓋了遺傳圖譜中1 450 cM范圍，圖譜中的標(biāo)記很快被應(yīng)用到其他品種或物種中檢測不同遺傳背景的數(shù)量性狀位點(diǎn)。KENIS 等[39]利用AFLP 和SSR 標(biāo)記，以Telamon 和Braeburn 雜交F1257 個植株個體為試材，構(gòu)建了蘋果的遺傳圖譜，并且通過2 個SSR 標(biāo)記把Telamon×Braeburn 的第17 個連鎖群和Liebhard 等構(gòu)建的遺傳圖譜整合在一起。此后，SILFVERBERG-DILWORTH 等[40]在Liebhard 等的基礎(chǔ)上，利用Fiesta 和Discovery 的雜交群體，又將開發(fā)的156 個SSR 標(biāo)記定位在該圖譜上，該蘋果遺傳連鎖圖中的SSR 標(biāo)記達(dá)到了300 個左右，而從中篩選出的86 個核心SSR 標(biāo)記可覆蓋85%的蘋果基因組。

隨著新一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，也使得繪制高質(zhì)量的蘋果基因組序列圖成為可能。2010 年借助于新一代測序平臺構(gòu)建了蘋果基因組的物理圖譜，以栽培品種金冠（Golden Delicious）蘋果為材料，VELASCO 等[41]共產(chǎn)生122 146 個重疊群，1 629 個拼接，總重疊群長度達(dá)603.9 Mb，約占估計蘋果基因組的81.3%。該研究表明，蘋果亞科植物發(fā)生過一次相對較新的全基因組復(fù)制，由原先祖先的9 個染色體轉(zhuǎn)變?yōu)?7 個染色體，進(jìn)行植物分類學(xué)后發(fā)現(xiàn)，栽培蘋果的祖先為新疆野蘋果（M. sieversii）。研究還發(fā)現(xiàn)，與果實發(fā)育相關(guān)的基因家族存在大量的基因復(fù)制現(xiàn)象。此項研究也為今后SSR 分子標(biāo)記在蘋果中研究的進(jìn)一步拓展和延伸奠定了基礎(chǔ)。

近年來，李爽[42]構(gòu)建了包含27 個SSR 標(biāo)記，遺傳距離為227.7 cM，分屬10 個連鎖群的蘋果遺傳圖譜。MORIYA 等[43]利用新開發(fā)的EST-SSR 標(biāo)記，構(gòu)建了蘋果砧木品種JM7 和蘋果屬三葉海棠Sanashi 63 的對齊式基因連鎖圖。王立新等[44]利用均勻分布于蘋果17 對染色體上的35 對多態(tài)性高、重復(fù)性好的SSR 引物，對40 個蘋果栽培品種進(jìn)行圖譜構(gòu)建。劉遵春等[45]以新疆紅肉蘋果和紅富士為材料，利用175 對SSR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了覆蓋17 條連鎖群、總共覆蓋基因組1 299.7 cM的蘋果遺傳連鎖圖譜。KHAN 等[46]構(gòu)建了包含2 875 個DNA分子標(biāo)記的高密度蘋果遺傳圖譜，圖譜總長度達(dá)1 991.38 cM，平均每條連鎖群上有169 個分子標(biāo)記，平均相鄰分子標(biāo)記之間遺傳距離為0.70 cM。ZHANG 等[47]基于公布的金冠蘋果基因組序列，開發(fā)了大量SSR 標(biāo)記，構(gòu)建了總長度為1 720.9 cM的蘋果遺傳連鎖圖譜。MA 等[48]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)與SNP 相結(jié)合，構(gòu)建了總長度1 368.4 cM的蘋果遺傳圖譜，該圖譜具有601 個分子標(biāo)記，其中，61 個SSR 標(biāo)記。

隨著蘋果遺傳連鎖圖譜的建立，人們運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對控制蘋果重要經(jīng)濟(jì)性狀的QTL 定位也取得了重要進(jìn)展。

3.2 抗病蟲相關(guān)QTL 定位

到目前為止，抗病蟲方面相關(guān)研究比較多，找到了一系列蘋果抗病蟲相關(guān)的基因和QTL 位點(diǎn)，同時也篩選到許多與抗性相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記。

3.2.1 在黑星病研究中的應(yīng)用 蘋果黑星?。╒erturia inaequalis（Cooke）wint）是廣泛分布于世界各蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，具有流行速度快、危害嚴(yán)重、難以防治等特點(diǎn)，該病主要危害葉片和果實，也侵染花朵和嫩枝，受害果實結(jié)痂開裂、畸形，使果實失去商品性，受害葉片早期脫落，影響次年產(chǎn)量，削弱樹勢。PATOCCHI 等[49-50]分別篩選到2 個抗黑星病基因Vr2 和Vm，并尋找到與抗性基因分別連鎖的SSR 分子標(biāo)記CH02c02a 和Hi07h02。GYGAX等[51]用SSR 和SCAR 標(biāo)記定位了蘋果黑星病抗性基因。ERDIN 等[52]以Golden Delicious×Hansen's baccata#2 雜交群體為試材，采用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)將抗性基因Vb 定位在染色體LG12 上，并篩選到與之連鎖的SSR 分子標(biāo)記Hi02d05 和Hi07f01。CALENGé 等[53]通過分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)了1 個主效基因Vg 和7 個抗病相關(guān)的QTL，并對各抗病QTL的具體位置與連鎖SSR 分子標(biāo)記及抗病特異性進(jìn)行了分析。DUREL 等[54]尋找到4 個QTL 位點(diǎn)，并篩選到在P11 和F11 上的QTL 位點(diǎn)與SSR 分子標(biāo)記CH04h02 緊密連鎖，在F17 上的QTL 位點(diǎn)側(cè)翼的SSR 分子標(biāo)記CH01h01。SOUFFLET FRESLON 等[55]分別在染色體LG6，LG11 和LG17 上發(fā)現(xiàn)抗黑星病QTL 位點(diǎn)，并篩選出與這些抗性QTL 位點(diǎn)連鎖的SSR 分子標(biāo)記CH03d7，CH04h02 和CH01h01。

3.2.2 在白粉病研究中的應(yīng)用 蘋果白粉?。≒odospharea leucoteicha）是一種真菌病害，該病主要危害蘋果葉片、枝條、花芽、幼果，造成葉片脫落，新梢枯死，嚴(yán)重影響樹勢，在我國蘋果產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍。目前，已經(jīng)篩選到許多與抗白粉病基因相連鎖的SSR 分子標(biāo)記。JAMES 等[56]將抗白粉病基因Pl-d 定位在LG12 末端，與Pl-d 連鎖的SSR 分子標(biāo)記分別是CH03C02 和CH01D03，抗白粉病基因Pl-d 與2 個SSR 標(biāo)記的遺傳距離分別為8，13 cM；JAMES等[57]將抗白粉病基因Pl-w 定位在LG8 上，其連鎖的SSR 分子標(biāo)記分別是CH01E12 和CH05A02，二者與抗性基因Pl-w 的遺傳距離分別為10，23 cM。DUNEMANN 等[58]利用SSR 標(biāo)記把白粉病抗性基因Pl1 定位在蘋果染色體LG12 的末端。CALENGé等[59]利用蘋果品種Discovery 與TN10-8 的雜交F1群體為試材，通過5 個季度的觀察，共發(fā)現(xiàn)7 個重要的與抗白粉病相關(guān)的QTLS，它們對后代表型變異的效應(yīng)為5.7%～27.4%。

3.2.3 在火疫病研究中的應(yīng)用 火疫?。‥rwinia amylovora（Burrill））是蘋果的一種極易傳染和毀滅性的細(xì)菌性病害。CALENGé 等[53]以Primer×Fiesta和Fiesta×Discovery 2 個不同群體為研究對象，找到了與蘋果火疫病抗性相關(guān)的QTL，并篩選到與QTL 位點(diǎn)最近的SSR 分子標(biāo)記。CALENGé 等[60]利用NBS 基因家族序列開發(fā)的分子標(biāo)記，鑒定和定位蘋果火疫病抗性基因。PEIL 等[61]對Idare×M.robusta 5 雜交群體的146 個后代植株進(jìn)行接種試驗，篩選出與抗性基因連鎖最近的SSR 分子標(biāo)記CH03e03，該標(biāo)記距離抗性基因位點(diǎn)的距離為9 cM。DUREL 等[62]在2 個F1群體中篩選到2 個QTL 位點(diǎn)，分別位于染色體LG12 和LG15 上，分別可解釋遺傳變異50%～70%和＞40%，并篩選到與它們連鎖的SSR 分子標(biāo)記Hi23d11y 和Hi07f01。

3.2.4 在蚜蟲研究中的應(yīng)用 蘋果蚜蟲，俗稱油汗，是蘋果園生產(chǎn)中的主要害蟲之一，它分泌黏液，吸食嫩梢和葉片，大量發(fā)生時，受害葉變形，光合功能下降，影響新梢生長。借助AFLP 和SSR 技術(shù)，利用Prima×Fiesta 的雜交群體，CEVIK[63]分離檢測到3 個新的抗蚜蟲基因位點(diǎn)，2 種方法得到的分子標(biāo)記僅相差1.3 cM，并且還表明Sd-1 與Sd-2 緊密連鎖，可能是等位基因。

3.2.5 在其他病害研究中的應(yīng)用 在蘋果生產(chǎn)中，還有一些其他的病蟲害嚴(yán)重制約著蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)。

在輪紋病方面，CUI 等[64]結(jié)合SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在對Jonathan×Golden Delicious 雜交的F1群體進(jìn)行抗輪紋病鑒定發(fā)現(xiàn)，植株的抗病性是由抗性基因和抗性QTL 位點(diǎn)共同作用來完成的。

在腐爛病研究方面，TAN 等[65]以Zisai Pearl×Red Fuji 雜交群體為試驗材料，分別檢測到一個與腐爛病相關(guān)的QTL，分別位于父本染色體LG16 和母本染色體LG9 上。BUTI 等[66]研究發(fā)現(xiàn)一個主效抗腐爛病QTL 位點(diǎn)及與之連鎖的2 個SSR 標(biāo)記Hi2f06 和CH05c06。

在早期落葉病研究中，李爽等[67]將抗早期落葉病基因定位到了遺傳連鎖圖譜第10 個連鎖群LG10 上，這也為抗早期落葉病育種提供了理論依據(jù)。

在褐斑病研究中，壽園園[68]利用6 年生紅玉×金冠雜種實生群體作為分離群體，結(jié)合SSR 標(biāo)記技術(shù)，篩選出1 對SSR 標(biāo)記CH01h10 與抗褐斑病基因連鎖，并將該抗性基因定位于蘋果LG8。

3.3 果實品質(zhì)方面的應(yīng)用

決定果品市場競爭力的主要因素是果實品質(zhì)，但影響果實品質(zhì)的因素有很多，包括感官品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等。

3.3.1 果實酸度研究中的應(yīng)用 姚玉新等[69]采用分離群體分組分析（BSA）法，利用140 對共顯性遺傳的SSR 引物篩選出遺傳距離為8 189 cM的蘋果酸度基因。王剛剛等[70]以富士×粉紅女士雜交F1的76 株群體為試材，采用BSA 法和SSR 技術(shù)篩選到與酸/低酸性狀基因連鎖的SSR 分子標(biāo)記。王雷存等[71]利用SSR 技術(shù)并結(jié)合集群分類分析法，獲得了2 個與果實酸度性狀緊密連鎖的距離分別為3.24，2.31 cM的分子標(biāo)記位點(diǎn)CH03d12104和CH03d12118，Ma1 與Ma2 對果實含酸量有控制作用。KUNIHISA等[72]在對Orin×kane 雜交群體研究中，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)篩選到與蘋果汁液、可滴定酸、可溶性糖、果實采收期、落果及果實顏色深度等相關(guān)的QTL 位點(diǎn)。

3.3.2 果實質(zhì)地研究中的應(yīng)用 POTTS[73]對蘋果硬度QTL 進(jìn)行了研究，并篩選到與之連鎖的SSR 分子標(biāo)記CH02b11 和CH05c04。

3.3.3 果實香氣研究中的應(yīng)用 DUNEMANN 等[74]在Discovery×Prima 雜交群體中，把蘋果香氣QTL定位在LG1，LG2，LG3，LG5，LG6，LG7，LG9，LG11，LG12，LG15，LG16 和LG17 上，并篩選到相連鎖的SSR 分子標(biāo)記。VERDU 等[75]以X5210×X8402 雜交而來的385 株植株為試材，對每個植株蘋果汁多酚含量的QTL 分析和候選基因定位進(jìn)行研究，篩選出6 個相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記。

3.3.4 果實褐變研究中的應(yīng)用 SUN 等[76]對紅玉和金冠構(gòu)建的遺傳群體研究中發(fā)現(xiàn)了3 對抗果實褐變的主效基因，其分別被定位在LG10，LG15 和LG17 上，并尋找到與它們連鎖的6 對SSR 分子標(biāo)記。3.3.5 蘋果果型指數(shù)研究中的應(yīng)用 SUN 等[77]用紅玉×金冠雜交群體篩選到了4 個SSR 標(biāo)記和1 個AFLP 標(biāo)記與果形指數(shù)主效基因連鎖，并把它們定位在染色體LG10，LG11，LG12 和LG13 上。

關(guān)于蘋果單果質(zhì)量和果實縱、橫徑的報道較多。其中，也有運(yùn)用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行研究的報道。DEVOGHALAERE 等[78]篩選到與抗性QTL 位點(diǎn)連鎖的SSR 標(biāo)記CH02g09。CHANG 等[79]分別篩選出與蘋果果實縱徑和橫徑相連鎖的SSR 分子標(biāo)記。

3.4 主要農(nóng)藝性狀方面的應(yīng)用

生長性狀相關(guān)基因定位研究方面，HEMMAT等[80]發(fā)現(xiàn)了與柱型基因Co 相連鎖的SSR 標(biāo)記。田義軻等[81]篩選到與柱形基因連鎖的3 個SSR 標(biāo)記，且與最近的SSR 標(biāo)記CH03dll 的遺傳距離為3.9 cM。2012 年，F(xiàn)ERNáNDEZ-FERNáNDEZ 等[82]將蘋果屬的142 個全基因組序列支架中的282.4 Mbp 的序列均定位到M.27×M.116 雜交的圖譜中。KENIS等[83]發(fā)現(xiàn)QTL 位點(diǎn)的一個主要集群位于Telamon上的Co 基因區(qū)域，并確認(rèn)了Co 基因?qū)淠拘螒B(tài)具有重要影響。2013 年，BALDI 等[84]發(fā)現(xiàn)了Co 基因與SSR 標(biāo)記Co04R12 共分離，且被定位在SSR 標(biāo)記Co04R11 和Co04R13 之間0.56 cm 距離的區(qū)域，對應(yīng)到金冠蘋果基因組序列的393 kb 范圍上，這為Co 基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

PILCHER 等[85]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對Malling9×Robusta 5 雜交群體進(jìn)行分析，并找到了控制蘋果矮化性狀的基因Dw1 位點(diǎn)，同時將該位點(diǎn)定位于LG5 上NZraAM18_700 和CH03a09 之間的2.5 cM內(nèi)。FAZIO 等[86]以親本Ottawa 3 和Robusta 5為試材，證明了Dw1 位點(diǎn)的存在，且發(fā)現(xiàn)位于LG12與之互作的Dw2 位點(diǎn)；以Geneva 935 和Budagovsky 9 為材料，構(gòu)建了包含1 841 個SNP 標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，證明Dw1 與Dw2 位點(diǎn)間的互作，同時在LG16 上發(fā)現(xiàn)另一個與植株生長相關(guān)的微效QTL。FOSTER 等[87]以Malling 9 和Robusta 5 為試驗材料，分別在LG5，LG11 上找到砧木誘導(dǎo)矮化的Dw1 位點(diǎn)和Dw2 位點(diǎn)，同時發(fā)現(xiàn)4 個較弱的QTL 位點(diǎn)分別定位在LG6，LG9，LG10 和LG12 上。HARRISON 等[88]以M432 蘋果砧木作圖群體為試材，找到了與根皮率相關(guān)的3 個QTL，其中Dw1，Dw2與前人研究一致，Dw3 位于LG13，并指出根皮率與蘋果砧木誘導(dǎo)矮化相關(guān)，并與接穗直徑呈顯著負(fù)相關(guān)。董軍等[89]以矮化蘋果砧木G.41 和喬化蘋果砧木新疆野蘋果（Malus sieversii）為親本構(gòu)建的188 株F1分離群體為試材，并于每個分離群體植株上嫁接富士冠軍。利用SSR 標(biāo)記技術(shù)，將砧木誘導(dǎo)矮化基因定位于蘋果LG5 染色體543 kb 區(qū)段內(nèi)，側(cè)翼標(biāo)記分別為L05024 和Hi09b04，其物理距離為4.048～4.591 Mb，并篩選到可能參與調(diào)控植株生長的候選基因MDP0000323212。

上述研究，通過SSR 分子標(biāo)記技術(shù)找出蘋果資源的抗病性、農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和相關(guān)基因之間的連鎖關(guān)系，為后續(xù)的蘋果研究奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蘋果研究的各個方面，到目前為止已經(jīng)在蘋果品種鑒定、親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL 定位等方面做了許多相應(yīng)的研究，同時也篩選出許多與目標(biāo)性狀相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記，但是真正用在輔助育種上的還很少，蘋果分子標(biāo)記輔助育種還處于相對落后的階段。篩選與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記是基因定位克隆和分子標(biāo)記輔助選擇育種的前提。與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記可以有針對性地對特定基因進(jìn)行輔助選擇，不受生態(tài)條件及植物生長年限的制約，可以簡便迅速地進(jìn)行雜種后代的早期選擇[90]。由于現(xiàn)有的SSR 標(biāo)記與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記較少，期待開發(fā)合成更多的SSR 分子標(biāo)記，提高標(biāo)記選擇的高效性和準(zhǔn)確性。