中藥及其有效成分逆轉(zhuǎn)耐藥性機(jī)制研究探析＊

李 萌，李園白，劉方舟，王 靜，楊 陽(yáng)

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所 北京 100700）

抗生素是臨床上用于治療由細(xì)菌感染引起的疾病的首選治療藥物，并取得了相當(dāng)好的療效，但臨床中抗生素過(guò)度地、不合理地使用，包括預(yù)防性使用抗生素，這些都導(dǎo)致了耐藥性菌株的產(chǎn)生、發(fā)展，且情況日益嚴(yán)峻。耐藥菌株的范圍正在不斷擴(kuò)大，自首次被發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MRSA）后，從革蘭氏陰性菌到革蘭氏陽(yáng)性菌，包括耐頭孢類(lèi)、耐碳青霉烯類(lèi)、耐氟喹諾酮類(lèi)等藥物所致的多重耐藥及泛耐藥菌株［1］。由耐藥菌株所引起的感染性疾病來(lái)勢(shì)更加兇猛，常規(guī)抗生素很難抑制耐藥菌株的生長(zhǎng)，其發(fā)病率增高、治療難度大、致死率高。多重耐藥與泛耐藥菌株的大面積爆發(fā)，導(dǎo)致患者面臨著“無(wú)藥可用”，其病死率明顯提高，嚴(yán)重影響人類(lèi)的生存與健康。

由于耐藥菌株的大范圍出現(xiàn)，研究學(xué)者們?cè)谘芯靠咕饔脵C(jī)制、研發(fā)新型抗菌藥物的同時(shí),也把研究的重點(diǎn)針對(duì)于耐藥菌株，包括如何提高其對(duì)抗菌藥物的敏感性、如何逆轉(zhuǎn)其耐藥性等方面。中藥含有多種有效的抗菌成分，中藥及其復(fù)方的抗菌作用過(guò)程是多環(huán)節(jié)、多目標(biāo)、多靶點(diǎn)的復(fù)雜作用過(guò)程。目前，鮮少有中藥耐藥菌的報(bào)道，這讓中藥逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用研究引起大家的注意，也成為研究的熱點(diǎn)之一。目前中藥逆轉(zhuǎn)耐藥性機(jī)制的研究已取得一些可喜的研究進(jìn)展。本文就中藥及其有效成分逆轉(zhuǎn)耐藥性作用機(jī)制研究概況闡述如下，供同行們參考。

1 中藥及其有效組分逆轉(zhuǎn)耐藥性的機(jī)制

1.1 抑制細(xì)菌生物被膜形成

細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌黏附于接觸表面，并分泌多糖基質(zhì)、脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[2]。生物被膜是為細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境而形成的，可以保護(hù)細(xì)菌免于抗菌藥物的殺傷作用。通常情況下，形成生物被膜的細(xì)菌會(huì)對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，因?yàn)樯锉荒た山档途w的代謝速率，降低藥物向菌體內(nèi)的滲透度，甚至促進(jìn)其水解[3]。因此，近年來(lái)研究學(xué)者們的聚焦點(diǎn)主要集中在如何抑制生物被膜的產(chǎn)生、甚至是如何清除生物被膜。以期通過(guò)抑制或消除生物被膜，從而解決患者反復(fù)感染發(fā)作、患者機(jī)體出現(xiàn)耐藥菌株等臨床問(wèn)題。

溫紅俠等學(xué)者[4]采用綠原酸干預(yù)銅綠假單胞菌體外生物被膜模型的方法進(jìn)行研究,其研究結(jié)果表明綠原酸可以抑制銅綠假單胞菌的生物被膜形成,對(duì)早期和成熟的生物被膜具有破壞作用,對(duì)于生物被膜內(nèi)銅綠假單胞菌與頭孢他啶（CAZ）有協(xié)同殺菌作用,并且強(qiáng)于紅霉素組。

同樣是針對(duì)銅綠假單胞菌的生物被膜研究，宋鴻等學(xué)者[5]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參水煎液能抑制銅綠假單胞菌黏附力，抑制其生物膜的形成；與左氧氟沙星聯(lián)合作用后，生物被膜內(nèi)存活菌數(shù)明顯減少（P ≤0.05），可增強(qiáng)左氧氟沙星對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的殺菌作用。

細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)可以通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)分子產(chǎn)物，介導(dǎo)細(xì)胞間的通信，這一過(guò)程可以調(diào)節(jié)細(xì)菌生物被膜的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)菌的密度達(dá)到閾值時(shí)，則會(huì)激活介導(dǎo)通信的信號(hào)分子或抑制某個(gè)相關(guān)基因表達(dá)，從而對(duì)生物被膜的行程產(chǎn)生影響。因此細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制研究將會(huì)成為抑制細(xì)菌生物被膜研究的新方向。李雪等[6]將主要研究對(duì)象選為AI-2 信號(hào)分子，該分子是細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵位點(diǎn)，通過(guò)luxS 基因的轉(zhuǎn)錄水平及其變化情況，探討不同藥物對(duì)AI-2分子的作用特點(diǎn)，以及其在表皮葡萄球菌形成過(guò)程中的生長(zhǎng)規(guī)律；其研究結(jié)果表明，由月桂酸單甘油酯、壬酸或這兩者組成的混合物，對(duì)生物被膜菌及AI-2分子有抑制作用，且當(dāng)苦參堿與月桂酸單甘油酯、壬酸的混合物聯(lián)用時(shí)，增強(qiáng)了對(duì)生物被膜菌及AI-2分子的抑制作用。

1.2 消除耐藥質(zhì)粒R

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌內(nèi)染色體外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的、且對(duì)細(xì)菌生存非必需的小型共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA 分子。作為遺傳因子,在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)普遍存在。R 質(zhì)粒通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同方式，在菌株之間以較高頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)移，因而可以從耐藥菌株轉(zhuǎn)移到敏感菌株，擴(kuò)大耐藥菌株的范圍。另一方面，在細(xì)胞分裂時(shí),R質(zhì)粒也不斷進(jìn)行復(fù)制，使其子細(xì)菌也帶有耐藥質(zhì)粒,從而使耐藥性能夠以更快的速度傳播。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥及其提取物對(duì)R 質(zhì)粒的一直或消除作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果明顯強(qiáng)于體外實(shí)驗(yàn)效果。在體內(nèi)細(xì)菌不僅受到藥物的作用，機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境、機(jī)體中的免疫因素，都極有可能影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)變化。

于軍等[7]將中藥射干的提取液作為質(zhì)粒消除劑，對(duì)銅綠膿假單胞菌（PA11株）分別在體內(nèi)、體外進(jìn)行質(zhì)粒消除試驗(yàn),使消除子恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)射干于體內(nèi)外對(duì)銅綠假單胞菌有較強(qiáng)抑制作用。

張文平等研究表明[8]，以含千里光的小鼠血清作為質(zhì)粒消除劑，對(duì)多重耐藥大腸埃希菌進(jìn)行了R 質(zhì)粒體外消除實(shí)驗(yàn)。其研究結(jié)果表明含千里光的小鼠血清對(duì)R質(zhì)粒的消除率要明顯高于千里光水浸液。從R質(zhì)粒消除的表型來(lái)看，含千里光的小鼠血清是的消除作用表現(xiàn)為多重耐藥性的丟失，且以對(duì)四環(huán)素的耐藥性消除最為明顯，而經(jīng)千里光水浸液的消除作用僅表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失。此外，除了因?yàn)檠逯兴幬飳?duì)R 質(zhì)粒的直接消除作用，藥物還可能對(duì)機(jī)體本身免疫功能起到激活或協(xié)同的作用。

1.3 抑制β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）

鈍化酶是由耐藥菌株所產(chǎn)生的，破壞甚至滅活各種抗菌藥物的活性。目前，細(xì)菌產(chǎn)生的鈍化酶或滅活酶主要包括β-內(nèi)酰胺酶[9]、氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物鈍化酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等。其主要通過(guò)水解或修飾抗菌藥物，破壞抗菌藥物的分子結(jié)構(gòu)，從而起到耐藥的作用。經(jīng)過(guò)部分體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有清熱解毒功效的中藥，包括黃芩、黃連、黃柏等，可能對(duì)目前臨床上分離出的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥性作用。

劉平等[10]對(duì)黃柏、黃連、黃芩、連翹和千里光五種中藥的水提物，采用瓊脂對(duì)倍稀釋法分別對(duì)高產(chǎn)AmpC 酶肺炎克雷伯菌和產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌的最低抑菌作用進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其MIC。試驗(yàn)結(jié)果表明這五種中藥的水提物對(duì)高產(chǎn)AmpC 酶肺炎克雷伯菌和產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌都有不同程度的抑制作用,其中抑制作用最好的黃芩水提物；且五種中藥水提物對(duì)產(chǎn)不同酶的菌株抑菌作用相似。

賈云鵬等[11]用試管二倍稀釋法確定三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲三種中藥復(fù)方對(duì)產(chǎn)酶大腸埃希菌的最小抑菌濃度（MIC），選取低于MIC 的不同濃度在規(guī)定時(shí)間下培養(yǎng)產(chǎn)酶大腸埃希菌,測(cè)定各中藥不同濃度的逆轉(zhuǎn)效果和最佳逆轉(zhuǎn)濃度，提取ESBLs 并測(cè)定酶活性和含量。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種中藥復(fù)方均可對(duì)產(chǎn)酶大腸埃希菌的酶活性起到抑制作用，進(jìn)而達(dá)到逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性。

陳勇川等[12]依次測(cè)定黃芩苷/黃芩素與苯唑西林對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的最低抑菌濃度（MIC）、細(xì)菌生長(zhǎng)密度（OD），再以青霉素結(jié)合蛋白（PBPS2a）膠乳凝集試劑盒檢測(cè)黃芩苷/黃芩素對(duì)PBPS2a生成的抑制效力。研究結(jié)果表明黃芩苷、黃芩素分別與苯唑西林協(xié)同作用時(shí)，對(duì)MRSA均有抑制作用，黃芩素的抑制作用明顯優(yōu)于黃芩苷，但MIC 的降低與兩者的濃度并未顯示出相關(guān)性。同時(shí)黃芩素對(duì)OD值有明顯降低作用，且下降程度與其濃度的正相關(guān)，而黃芩苷對(duì)OD 值并無(wú)明顯作用。黃芩苷和黃芩素均有抑制MRSA 的PBPS2a 表達(dá)的效果,且其抑制效果與黃芩苷和黃芩素同樣正相關(guān)。

1.4 抑制耐藥基因的表達(dá)

細(xì)菌的耐藥性通常是由于細(xì)菌染色體基因突變或是獲得外源耐藥基因，以及這兩種耐藥機(jī)制并存而引起的。細(xì)菌能改變抗菌藥物作用靶位的蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，導(dǎo)致其與抗菌藥物結(jié)合的有效部位發(fā)生改變，影響藥物的結(jié)合，使細(xì)菌對(duì)該藥物不再敏感。通常情況下，基因突變所引起的細(xì)菌耐藥性是不可傳播的，如細(xì)菌對(duì)氟喹酮類(lèi)抗生素的耐藥就是由細(xì)菌基因突變引起的，但大多數(shù)細(xì)菌的耐藥性都是由于獲得了外源耐藥基因引起的。

鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床上耐藥情況嚴(yán)重，李娟等學(xué)者[13]從臨床分離的53株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行試驗(yàn)研究，其結(jié)果表明對(duì)臨床常用的14 種抗菌藥物耐藥率均較高（大于50%），其中氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢西丁耐藥率最高；另一方面，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白花丹醌與羰基氰化氯苯腙均顯示了對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、米諾環(huán)素和氯霉素的增敏作用,白花丹醌作為一種中藥單體可能具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

游思湘等[14]篩選出6株對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等抗菌藥均具有抗藥性的、乳源性耐藥金黃色葡萄球菌，通過(guò)對(duì)復(fù)方黃連注射劑的含藥血清藥理學(xué)研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿是其主要有效抗菌成分，因而復(fù)方黃連注射劑含藥血清對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌具有明顯的耐藥抑制作用。

大量研究表明，耐藥島是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）產(chǎn)生多重耐藥行的主要機(jī)制之一，其中攜帶的mecA 基因的SCC-mec 耐藥島在MRSA 產(chǎn)生耐藥行的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。此外，fem 基因家族和細(xì)菌胞膜上的主動(dòng)外排系統(tǒng)也與MRSA的多重耐藥性相關(guān)[15,16]。

管翠萍等[17]通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察在黃芩提取物在不同抑菌濃度作用下對(duì)MRSA 耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果，并通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)耐藥基因mecA 在mRNA 表達(dá)水平上的變化。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)黃芩質(zhì)量濃度為130 mol·L-1時(shí)，可有效下調(diào)mecA 的表達(dá)量。因?yàn)镻BP2a蛋白是由mecA基因編碼和調(diào)控的，該蛋白對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的親合力很低[18]，因此當(dāng)mecA的表達(dá)量下降時(shí)，相應(yīng)的PBP2a蛋白量也會(huì)降低，從而恢復(fù)MRSA菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的敏感性。

1.5 抑制耐藥菌外排泵

細(xì)菌的主動(dòng)外排機(jī)制可以使菌體主動(dòng)排出其內(nèi)部的抗菌藥物，導(dǎo)致藥物濃度降低，進(jìn)而減弱甚至失去抗菌作用，導(dǎo)致耐藥。其作用機(jī)制與細(xì)菌的多重耐藥性有關(guān)，特別是與細(xì)菌外膜通透性改變產(chǎn)生協(xié)同作用，因而產(chǎn)生細(xì)菌的多重耐藥性[19]。主動(dòng)外排機(jī)制是多數(shù)耐藥菌株的主要耐藥機(jī)制之一，也是多重耐藥性產(chǎn)生的重要原因之一。例如大腸埃希菌外膜基因的突變導(dǎo)致F、C 蛋白減少或缺失，使細(xì)菌的細(xì)胞壁或其外膜通透性改變，因而產(chǎn)生了多重耐藥[20]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中藥還可以通過(guò)抑制多種外排泵來(lái)逆轉(zhuǎn)耐藥。

宋戰(zhàn)昀等學(xué)者[21]制備了64 種中藥提取物，并分別對(duì)其進(jìn)行含有norA 的多重耐藥金黃色葡萄球菌菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有14 種中藥提取物（包括黃連、艾葉、地榆、柯子、木孜、烏梅、防己、半枝蓮、柴胡、肉蓯蓉、吳茱萸、大黃、金蓮花和連翹）對(duì)金黃色葡萄球菌有不同程度的抑菌作用。從無(wú)抑菌作用的50種中藥提取物中，篩選出對(duì)多重耐藥金黃色葡萄球菌有抑制作用的外輸泵蛋白抑制劑，得到浙貝母、射干、穿心蓮、菱角四種中藥提取物對(duì)人工構(gòu)建的金黃色葡萄球菌多重耐藥菌株都能起到一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

張弛等[22]檢測(cè)中藥單體白花丹醌、二氫丹參酮、葫蘆素、鹽酸小檗堿和紫胡皂苷d 對(duì)替加環(huán)素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌作用；選取CCCP、PAβN 及白花丹醌作為外排泵抑制劑[23]，觀察外排抑制試驗(yàn)結(jié)果。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與外排泵抑制劑CCCP、PAβN 相比較，白花丹醌與CCCP 的外排陽(yáng)性率相同，且二者均高于PAβN。因此白花丹醌聯(lián)合替加環(huán)素表現(xiàn)為相加作用，可能與外排泵抑制有關(guān)。

郭威等研究發(fā)現(xiàn)[24]外排泵MexAB-OprM主要在穩(wěn)定生長(zhǎng)期表達(dá),穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制作用使其可恢復(fù)部分抗菌藥物的敏感性,而這種作用并非通過(guò)抑制C4-HSL的分泌而實(shí)現(xiàn)。

2 討論

中藥抗菌具有較好的前景，它作用于抗菌的各個(gè)環(huán)節(jié)，一方面可以直接作用于微生物本身，例如小檗堿、大蒜素、魚(yú)腥草素等中藥有效成分；另一方面通過(guò)調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的積極性，來(lái)殺滅微生物。調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，能有效延緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此部分中藥或中藥復(fù)方具有一定的抗菌作用。但是中藥的抗菌作用相對(duì)周期較長(zhǎng)，使用劑量也比較大［25］，因此可以考慮在臨床上，中藥與抗生素聯(lián)用或提取其有效成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)改造以增強(qiáng)抗菌效果。

目前針對(duì)中藥及其有效成分的抗菌及逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制的研究，主要是以體外試驗(yàn)為主，并且大部分是針對(duì)單獨(dú)耐藥菌株的研究，而針對(duì)菌群的研究相對(duì)較少。中藥發(fā)揮抗菌作用不僅是殺滅細(xì)菌，更是在于調(diào)節(jié)和平衡菌群與人體之間的狀態(tài)，這與我們常說(shuō)的在消滅感染的同時(shí)要維持菌群平衡的理念相吻合。但中藥及其有效成分作用于人體或是靶器官是一個(gè)多層面、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，其抗菌作用機(jī)制、逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性作用機(jī)制、各有效成分的作用靶點(diǎn)、作用途徑之間是否具有協(xié)同作用等問(wèn)題還有待進(jìn)一步的深入研究。