HIV的實驗室檢測方法研究進展

臧 旭

獲得性免疫缺陷綜合征（艾滋?。┦悄壳坝蒆IV病毒引起的最具破壞性的疾病之一，傳染性強，病死率高。從全球范圍來看，非洲區(qū)域病情最嚴重，僅2017年艾滋病毒新發(fā)感染數(shù)占全球的近2/3。我國自1985年發(fā)現(xiàn)第一例艾滋病患者以來，艾滋病患者不斷增多。2010年—2016年，中國艾滋病發(fā)病數(shù)和死亡人數(shù)總體呈上升趨勢。2017年全國艾滋病發(fā)病數(shù)已達57 194例，是2010年全年發(fā)病數(shù)的近3倍［1］。

研究表明，從靈長類慢病毒到人類的HIV的跨物種傳播，病毒可以在系統(tǒng)發(fā)育上分為兩類；HIV-1和HIV-2［2］。這種區(qū)別對于準確監(jiān)測和診斷以及在人群中施用適當?shù)目狗崔D(zhuǎn)錄病毒療法至關重要，目前艾滋病毒1型（HIV-1）是人類反轉(zhuǎn)錄病毒中的第一種，占世界艾滋病毒感染的95%以上［3］。艾滋病病毒在人體內(nèi)的平均潛伏期為8～9年，患者無任何癥狀，外表與常人無異，但是由于HIV病毒主要攻擊的是人體的免疫系統(tǒng)，一旦侵入機體細胞，病毒將會和細胞整合在一起終生難以消除，T4淋巴組織受損導致人體最終因合并感染各種疾病甚至死亡［4］。HIV病毒廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、乳汁、腦脊液、有神經(jīng)癥狀的腦組織液中，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高［5］，最主要的傳播方式也是通過傳播以上幾種物質(zhì)產(chǎn)生，如性傳播、血液傳播和母嬰傳播［6］。由于艾滋病病毒的高致病性及傳染性，早期對疑似感染者的檢測就顯得尤為重要。目前檢測HIV感染者體液中病毒抗原和抗體的方法，操作方便，易于普及應用，其中抗體檢測尤為普遍［7］。但HIV P24抗原和病毒基因的測定，在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視［8］。該文就近年來HIV實驗室檢測的研究進展和發(fā)展趨勢綜述如下。

1 抗體檢測

1.1 初篩實驗 血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據(jù)其主要的適用范圍，可將現(xiàn)有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。初篩主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），凝膠顆粒凝集試驗，乳膠凝集試驗，放射免疫試驗和各種快速檢測試驗等［9］。ELISA可使用血液、唾液、尿液樣品將已知的抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗體反應在固相表面進行的技術。其中ELISA是目前進行HIV抗體初篩最有效也是最常用的檢測手段，目前ELISA的試劑已開發(fā)到第4代［10］。第1代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應板，由于含有宿主細胞成分的污染和雜蛋白的存在，故假陽性較高。目前國內(nèi)外主要使用第3代（雙抗原夾心法）試劑。血液樣品的篩查仍以第3代ELISA為主，國際上有些國家和地區(qū)已將第4代ELISA試劑用于血源篩查，目前第4代ELISA試劑可同時檢測p24抗原和HIV-1/2抗體［11］。吳忠華等對目前市售的三種進口第4代試劑盒進行性能評價，發(fā)現(xiàn)所用的第4代試劑敏感性均高于第3代檢測試劑［12］。與第3代試劑相比，第4代試劑檢測窗口期大約平均縮短4～5 d［13］。第1代到第 4代的ELISA檢測方法對比研究結果發(fā)現(xiàn)，ELISA試驗適合用于大批量標本的檢測，而第3代ELISA更適用于目前的臨床檢測條件，因其具有較高的特異性和敏感性［14］。由于ELISA檢測依賴于化學發(fā)光和時間分辨熒光免疫分析技術等方法，其靈敏度較低，并且第4代試劑的成本更高，所以若全面取代第3代檢測試劑，還需要進一步研究和考證。

由于HIV的高危險性，對于檢測試劑和手段的需求不僅包括高特異性和靈敏度，同時也要求更加方便快捷準確，所以進行HIV的快速檢測試驗（RT），能夠在 10～30 min內(nèi)得到結果，可用于急診檢測。包括凝膠顆粒凝集試驗（PA），它是通過包被HIV抗原的顆粒凝集來檢測抗體的存在，根據(jù)其凝集反應判斷結果；免疫斑點試驗，通過使用硝酸纖維膜作為固相載體，將HIV固定在其膜上，加入樣品后陽性結果將以有色斑點的形式出現(xiàn)在膜上抗原部位；免疫層析試驗，以硝酸纖維膜為載體將HIV抗原固定在膜上，加入待測樣品后由于層析作用復合物沿著固相載體遷移，陽性結果以紅色條帶的形式產(chǎn)生，由于該方法靈敏度不及ELISA試驗但是試劑可以常溫保存并且步驟簡單快速，所以適用于基層實驗室篩查［15］。 張宏萍［16］對三種 HIV 的篩查方法進行比較，即，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、明膠顆粒凝集試驗（PA）和免疫斑點試驗，對于初篩陽性標本都沒有漏檢現(xiàn)象，檢出率敏感性均為100%；PA法檢測時不需要任何儀器但是相對檢測時間較長，免疫斑點試驗試劑穩(wěn)定操作簡便且特異性高于ELISA和PA法。劉福榮［17］對RT法與ELISA法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)ELISA假陽性率為80%（40/50），RT法為23.5%（4/17）RT法測定HIV結果的假陽性率低于ELISA法，RT的特異性高于ELISA試驗。

1.2 抗體確證實驗 由于HIV檢測需要高度的準確性所以初篩并不能保證較高的特異性，還需要進一步的確證實驗，包括免疫印跡試驗（WB）、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗（RIPA）及免疫熒光試驗（IFA）等。目前實驗室診斷HIV最常用的確證方法是免疫印跡試驗（WB），由于其靈敏度和特異度較高也是《全國艾滋病檢測技術規(guī)范2009版》中首選的確認方法［9］。免疫印記法是將HIV裂解成不同的片段，在凝膠電泳過程中，病毒不同蛋白按分子量的大小順序排列，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進行特異性抗體孵育后與酶標二抗共同顯色，根據(jù)其出現(xiàn)兩條以上的條帶則能夠判定HIV陽性［18］。由于WB法實驗操作步驟較多，對技術要求高可控性不理想，所以作為HIV的首選確證方法仍需要進一步研究。在進行篩查試驗與WB試驗間的關系研究中顯示，HIV抗體復核的468例樣本中，兩種ELISA檢測方法均呈陽性反應的464例，與WB符合率99.13%，所有的確證樣本中，HIV-1抗體特異帶的gp160、gp120、gp41、p24 的出現(xiàn)都在 98.00%以上，研究證明ELISA初篩實驗存在一定假陽性結果，最終判斷還需以確證實驗結果為準［19］。但是即使WB作為應用最廣泛的確證方法也存在漏檢風險［20］，有學者研究發(fā)現(xiàn)WB法存在一定錯誤判斷，將僅有包膜蛋白（gp41+gp20/gp160）或 gag+包膜（p24+gp41或gp120/gp160）的部分人群判斷為HIV陽性，假陽性率甚至達到8%［21］。所以目前針對WB檢測可能出現(xiàn)漏檢的問題，多通過初篩4代陽性+3代陽性樣本，WB確證陽性判別HIV感染患者，若4代陽性+3代陰性樣本，WB檢測存在漏檢問題，需要補充核酸試驗確定［22］。 王佑春［23］對于確證試驗的幾種方法進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)IFA試驗的特異性和敏感性比ELISA試驗更好，并且與WB相比更易操作，IFA法可以作為WB試驗的簡單替代法。

2 HIV抗原檢測

p24抗原是HIV-1的核心蛋白，在HIV入侵人體后p24的發(fā)生水平能夠隨病毒的復制而發(fā)展，所以HIV-1 p24抗原能夠在患者早期樣本中檢測出來，檢測時間早于HIV抗體，因此將p24抗原的檢測用于早期感染，目的縮短窗口期［24］。p24能夠在感染后約2～3周內(nèi)檢出，但隨著抗體的中和作用，游離性抗原減少，此時對于抗原檢測會出現(xiàn)一定程度的影響，機體此時進入無癥狀感染期。疾病后期p24抗原水平會隨著病毒的復制再次增強，所以p24抗原檢測可以作為HIV的早期診斷方法，監(jiān)測其濃度變化可以反映病情進展［25］。對于HIV-1 p24的抗原檢測主要有ELISA、放射免疫分析、IFA等技術。通常ELISA法是檢測p24抗原的有效手段，但是也存在假陽性可能，所以需要進一步確證實驗。楊曉亮等［26］將使用第4代增加了P24抗原檢測系統(tǒng)的ELISA與膠體硒法、WB法的檢測結果進行比較，結果發(fā)現(xiàn)第4代ELISA試劑檢測、膠體硒檢測及WB檢測HIV的陽性率分別為0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏檢率（1.3%）低于膠體硒法（4.9%），而其檢測HIV的假陽性率（0.03%）高于膠體硒試劑（0.01%）。近年來，隨著科學技術的不斷突破，針對抗原檢測的新方法也在應用當中，如免疫復合物裂解檢測法（ICD）、超敏感酶免疫測定法（UEI）、免疫吸附電鏡法（ISEM）、線性免疫酶測定（LIA）、熒光聯(lián)結抗原定量法（FLAQ）［27］。 有研究顯示，免疫復合物裂解檢測法目前的敏感性已提高到90%［18］。雖然p24抗原檢測方法的靈敏度得到大幅提高但是還不能代替RNA病毒的測定，還需要進一步的研發(fā)。

3 HIV核酸檢測

核酸檢測是目前最敏感的HIV檢測手段，其測定方法大致上分為反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、分支DNA 信號放大系統(tǒng)（bDNA）、核酸序列依賴性擴增（NASBA）和連接酶酶促鏈式反應（LCx）4種。目前臨床上應用的自動PCR檢測系統(tǒng)能夠?qū)CR擴增過程和檢測限值在單個反應管中進行，避免了實驗過程中的污染［9］。 楊成勇等［21］使用病毒核酸載量法和HIV-1 RNA的巢式反轉(zhuǎn)錄PCR（nested RTPCR）法與WB方法進行對比，研究結果發(fā)現(xiàn)該研究表明對只有 gp160、p24 和 gp160、gp120、p66、p24 的特殊陽性標本和以p24為主的抗體不確定標本需要用RT-PCR或NASBA方法進行核酸檢測，以進一步確認。在不確定標本的鑒定方面，繆禮鋒等［28］將核酸定量方法與血清學方法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)針對env帶的不確定標本預示有較大的感染風險，尤其是gp160、gp120和gp160、p24兩種帶型，須做進一步的隨訪和鑒別診斷；應當視情況采用核酸方法鑒別診斷；病毒載量檢測是鑒別不確定標本的有效方法。核酸檢測技術能夠進行定性定量的檢測，并且特異性強、靈敏度高，但由于所需的試劑、儀器昂貴，費用高，真正運用到常規(guī)檢驗工作中存在一定難度。

4 耐藥性檢測

世界在抗擊艾滋病方面取得了重大進展——在過去的40年里，艾滋病已經(jīng)奪走了3500萬人的生命。隨著越來越多的人獲得拯救生命的治療，每年的死亡人數(shù)都在急劇下降。但也遇到了一些挫折，最明顯的就是耐藥性的增強［29］。HIV-1遺傳變異是HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶（RT）高速率復制發(fā)生錯誤的結果，耐藥菌株的產(chǎn)生是由于病毒復制過程中的不完全抑制治療，幾乎臨床上所有的耐藥菌株均來自于藥物的選擇壓力［30］。HIV耐藥性的檢測分為：基因型檢測法，通過DNA序列檢測耐藥性點突變；表型檢測法，通過檢測病毒在多種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥濃度中的生長能力判斷是目前耐藥性檢測的金標準。李晶等［31］對HIV-1耐藥性基因檢測法在臨床應用中進行評價，結果顯示對HIV-1耐藥性基因型檢測法能有效地監(jiān)測感染者血漿中耐藥性病毒株的存在，該方法提供的結果準確、可靠。就目前我國臨床治療現(xiàn)狀，王露等［32］發(fā)現(xiàn)我國應用抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者中耐藥性的產(chǎn)生已經(jīng)十分嚴重，尤其是針對NNRTIs的高度耐藥性較為突出，迫切需要應用耐藥性檢測進行指導。

綜上所述，目前，中國的艾滋病疫情呈現(xiàn)幾個顯著特點：一是艾滋病疫情上升幅度進一步減緩，艾滋病綜合防治效果開始顯現(xiàn)；二是性傳播持續(xù)成為主要傳播途徑，同性間的傳播，上升速度明顯；三是全國艾滋病總體呈低流行態(tài)勢，部分地區(qū)疫情嚴重；四是全國艾滋病受影響人群增多，流行模式多樣化。由于時間和成本的限制，在我國有些醫(yī)療點或資源有限的環(huán)境中進行艾滋病毒診斷會帶來相當大的挑戰(zhàn)。對HIV的檢測，靈敏度及特異度高的分析方法將有助于HIV的早期診斷，避免漏檢，目前，基于核酸的測試是診斷感染后窗口期和血清轉(zhuǎn)化前最近感染的唯一可靠方法，但這些測試僅適用于裝備精良的實驗室環(huán)境。對于更方便快捷，經(jīng)濟性準確性更高的實驗室檢測方法還需要進一步研究開發(fā)。