結(jié)直腸癌EMT相關(guān)LncRNA的研究進(jìn)展

蘇 丹 何祖坤綜述 白 松審校

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，在全球范圍內(nèi)為男性第3位、女性第2位，每年新發(fā)約120萬(wàn)例，死亡約60 萬(wàn)例[1]，在中國(guó)結(jié)直腸癌致死居于惡性腫瘤的第5位[2]。結(jié)直腸癌確切病因眾多且異質(zhì)性強(qiáng)，目前認(rèn)為主要是基因突變和基因表達(dá)水平綜合作用的結(jié)果[3-5]。雖然目前針對(duì)結(jié)直腸癌有多種療法，包括手術(shù)，化療及針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和程序性細(xì)胞凋亡蛋白1(PD-1)/程序性細(xì)胞凋亡蛋白配體1(PD-L1)等靶點(diǎn)的靶向治療，患者通常還是會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。高的腫瘤分期(TNM3和4)、特定的定位(如左結(jié)腸)、組織學(xué)(腫瘤中基質(zhì)細(xì)胞的含量)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI穩(wěn)定)是惡化的標(biāo)志。腫瘤的轉(zhuǎn)移是1個(gè)多步驟、多階段、多途徑、涉及多基因變化的一系列復(fù)雜過(guò)程，其中癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 是造成轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，并且受到一系列基因表達(dá)變化的調(diào)控。LncRNA的主要功能就是通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的復(fù)合物活性及其他復(fù)雜機(jī)理控制下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，包括EMT相關(guān)基因。 近幾年，LncRNA(長(zhǎng)鏈非編碼RNA)與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究也逐漸增加,很多證據(jù)預(yù)示二者之間關(guān)系密切。

1 LncRNA的生物學(xué)功能

LncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基，因缺少開(kāi)放閱讀框不編碼蛋白質(zhì)的RNA，可以位于細(xì)胞核內(nèi)或胞質(zhì)中。LncRNA參與了廣泛的生物途徑和細(xì)胞過(guò)程，具有保護(hù)蛋白編碼基因、參與X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)功能。根據(jù)與蛋白編碼基因的位置關(guān)系，可分為5種類型：正義、反義、雙向、內(nèi)含子間和基因間LncRNA。形成方式有 5 種:①編碼蛋白質(zhì)的基因在多種因素作用下斷裂后形成;②染色質(zhì)重排過(guò)程中 2 個(gè)分開(kāi)的區(qū)域緊靠到一起后通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成;③非編碼基因轉(zhuǎn)錄;④小非編碼 RNA 中的某段序列多次復(fù)制;⑤轉(zhuǎn)錄因子中插入一段序列[7]。

Chew等[8]報(bào)道很多LncRNAs是蛋白質(zhì)編碼的污染物，其主要通過(guò)基因組中的不同區(qū)域的RNA pol II轉(zhuǎn)錄，起初認(rèn)為沒(méi)有實(shí)質(zhì)性作用。但最近研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA的變化和失調(diào)與不同癌癥的預(yù)后、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。很多研究表明LncRNA在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，其中在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、結(jié)直腸癌中研究頗多。所以LncRNA有望成為臨床上診療以上惡性腫瘤的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA，即Hotair，是長(zhǎng)度為2158 nt的LncRNA，包括5個(gè)短外顯子和1個(gè)長(zhǎng)外顯子，位于染色體12q13,13區(qū)域。Hotair的5'端可以與PRC2(多梳抑制復(fù)合體2)相互作用，包含EZH2，SUZ12和EED 3個(gè)主要亞基，促進(jìn)調(diào)控染色質(zhì)組蛋白H3賴氨基酸27三甲基化(H3K27me3)，以沉默HOXD及其他靶基因轉(zhuǎn)錄；Hotair的3'端可與LSD1(稱賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶-1)結(jié)合，促進(jìn)組蛋白H3K4去甲基化，以沉默抑癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9-10]。Hotair基因結(jié)構(gòu)具有高度保守性，但基因序列保真度低。其中，超保守序列與腫瘤中的原癌基因有關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，當(dāng)其異常表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞惡變。

Hotair可作為不同類型癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物，測(cè)量Hotair的表達(dá)水平有助于我們預(yù)測(cè)癌癥的階段并評(píng)估生存質(zhì)量和生存期。

2 影響Hotair表達(dá)的主要相關(guān)因素

Hotair的表達(dá)主要通過(guò)兩方面的機(jī)制來(lái)調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性調(diào)控和傳統(tǒng)的通過(guò)轉(zhuǎn)錄區(qū)域上游啟動(dòng)子CPG島甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，Hotair的下游的CPG島DNA甲基化模式對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生重要影響[11]。

除受到基因組特定區(qū)域甲基化影響，Hotair的轉(zhuǎn)錄水平也受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。比如骨橋蛋白(OPN)，1個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)中的磷酸糖蛋白，可以轉(zhuǎn)錄激活并增加癌細(xì)胞中的Hotair的表達(dá)。CD44受體是OPN的正向調(diào)控因子，可間接影響Hotair的表達(dá)水平；相反，干擾素調(diào)控因子1(IRF1)通過(guò)綁定到啟動(dòng)子上直接抑制Hotair的表達(dá)。實(shí)際上，OPN可以控制IRF1，通過(guò)影響其信號(hào)通路促進(jìn)Hotair的表達(dá)，并抑制IRF的功能[12]。

C-myc與Hotair上游約1053處的E-box元件結(jié)合，上調(diào)Hotair的表達(dá)，通過(guò)siRNA敲低C-myc可減少Hotair的表達(dá)，降低其啟動(dòng)子的活性，而C-myc上調(diào)則可增加Hotair的表達(dá)，并增加其啟動(dòng)子的活性[13]。Cai等[14]發(fā)現(xiàn)，與Hotair表達(dá)水平低的人群相比，Hotair表達(dá)水平高的人群結(jié)直腸癌發(fā)生率更高。Alves等[15]研究了Hotair在 EMT中的作用及其在腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的發(fā)生和維持中的作用，他們揭示Hotair通過(guò)觸發(fā)EMT和獲得干細(xì)胞特性在致瘤過(guò)程中起重要作用。

轉(zhuǎn)錄后Hotair的穩(wěn)定性也受到其他因素的調(diào)控，例如 在microRNA-141的介導(dǎo)下，Hotair可被argonante2(Ago2)復(fù)合物抑制，進(jìn)而降低Hotair在腫瘤細(xì)胞中的RNA穩(wěn)定性和豐度。

3 與結(jié)直腸癌相關(guān)LncRNA

前報(bào)道與結(jié)直腸癌相關(guān)的LncRNA主要包括：H19、Hotair、MALAT1、MEG3、CCAT1、CRNDE、HuLc、KcNQ10T1、LncRNAP21、NPTN-IT1、SNHG16、ATB、LS1NCT5[16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本(SPRY4-IT1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA-ATB)、TUG1和LINC01133在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，SLC25A25-AS1和LncRNA-CTD903表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)結(jié)直腸癌EMT的發(fā)生[17]。他們主要影響與結(jié)直腸癌相關(guān)的信號(hào)通路有：Wnt、RAS-MAPK、PI3k、TGF-β、P53。

3.1 H19與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

H19 在細(xì)胞中的作用途徑很多，研究最為深入的主要是3個(gè)，一是Cai等[18]研究發(fā)現(xiàn)H19 作為miR-675 的前體，在分解過(guò)程中通過(guò)釋放miR-675來(lái)起作用。Tsang等[19]認(rèn)為H19 通過(guò)其產(chǎn)物miR-675來(lái)抑制抑癌基因RB的表達(dá)，從而在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到一種癌基因的作用。有薈萃分析通過(guò)H19與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，H19 高表達(dá)組腫瘤分化較低，無(wú)病生存率(PFS)和總生存率(OS)均降低[20]。二是Liang等[21]研究報(bào)道H19可吸附并消耗miR-138和miR-200a從而發(fā)揮ceRNA的作用，促進(jìn)EMT相關(guān)分子Vimentin，ZEB1和ZEB2的表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；三是Han等[22]發(fā)現(xiàn)H19通過(guò)招募eIF4A3促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。通常，周期蛋白包括G1期、S期和M期蛋白3種，CyclinD1可與CDK4特異性結(jié)合，形成CyclinD1-CDK4復(fù)合體，推進(jìn)G1期向S期的進(jìn)程[23]。 H19主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，siH19可使細(xì)胞周期G1到S期的進(jìn)展受到阻滯，因此，推測(cè)H19通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮調(diào)控CyclinD1和CDK4的作用，從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[24]。另外，Yoshimizu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠結(jié)腸息肉數(shù)量上升伴隨著H19的顯著低表達(dá)，說(shuō)明H19可能具有癌基因和抑癌基因的雙重作用。 Fellig等[26]通過(guò)檢測(cè)H19在37例結(jié)直腸癌并且肝轉(zhuǎn)移的肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)50%存在高表達(dá)，這說(shuō)明H19可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果顯示H19可能是結(jié)直腸癌潛在新癌基因和預(yù)后因子，有望成為未來(lái)檢測(cè)結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物。

3.2 Hotair與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

Kogo等[27]報(bào)道：Hotair上調(diào)與結(jié)直腸癌不良預(yù)后有關(guān)；認(rèn)為HOTAIR與PRC2協(xié)同調(diào)控多種基因的表達(dá)，并可提高CRC患者未分化癌細(xì)胞的水平。Hotair誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中SUZ12，EZH2和PRC2的表達(dá)上調(diào)，從而增加H3K27me3修飾水平[28]。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用下的過(guò)程?；虻倪z傳變異，如腫瘤相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、信號(hào)通路、效應(yīng)分子的單核昔酸多態(tài)性(SNP)，可通過(guò)影響基因結(jié)構(gòu)而影響其功能，從而在環(huán)境因素的作用下發(fā)揮不同的效應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生。其中tagSNPS影響Hotair的基因組區(qū)域，通過(guò)改變Hotair的結(jié)構(gòu)參與結(jié)直腸癌，其在癌癥中的作用僅有Zhang等報(bào)道[29]。 rs7958904位于Hotair基因的第6外顯子上，CC基因在老年受試者中對(duì)結(jié)直腸癌有顯著的保護(hù)作用[30]。rs7958904(影響Hotair)的CC基因型明顯降低結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)；rs4759314(影響Hotair)的GG基因型受試者患結(jié)直腸癌的發(fā)生率明顯低于攜帶AA基因型的受試者。研究結(jié)果顯示，Hotair的表達(dá)水平可作為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的新指標(biāo)。

3.3 MALAT1與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

Li等[31]發(fā)現(xiàn)，MALAT1 在結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株中異常表達(dá)，對(duì)于高表達(dá)MALAT1的患者，MALAT1將EZH2與CDH1啟動(dòng)子連接，并在奧沙利鉑治療期間抑制miR-218，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT;但對(duì)于低MALAT1表達(dá)的患者，MALAT1不能抑制E-鈣粘蛋白和表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了MALAT1通過(guò)EZH2介導(dǎo)的H3K27me3在結(jié)直腸癌中形成來(lái)降低E-鈣粘蛋白表達(dá)。敲除MALAT1 后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)增加、Vimentin 表達(dá)減少，細(xì)胞間連接增加，細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。而奧沙利鉑則通過(guò)MALAT1 / EZH2途徑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療耐藥。另一研究表明MALAT1通過(guò)增加AKAP-9的表達(dá)，在體外和體內(nèi)促進(jìn)結(jié)腸直腸癌(CRC)細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移[32]。Xu等[33]在研究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)MALAT1 在50%的結(jié)腸癌樣本中呈高表達(dá)，并且MALAT1 的3'末端區(qū)域存在突變，進(jìn)一步研究證明MALAT1 的3'末端區(qū)域突變?cè)诮Y(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要作用。以上研究結(jié)果顯示MALAT1可能作為奧沙利鉑抗結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)，同時(shí)可能成為診斷結(jié)直腸癌的新腫瘤標(biāo)志物，具有臨床價(jià)值。

3.4 其他LncRNA與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

近期研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，CCAT1較Hotair更有效早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌。 ncRuPAR在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，同時(shí)表達(dá)水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。HOTTIP可以結(jié)合并靶向WDR5-MLL復(fù)合物至5'HOXA基因座，促進(jìn)HOXA啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生H3K4me3修飾從而轉(zhuǎn)錄激活[34]。HOTTIP影響結(jié)直腸腫瘤的大小和病理分期[35]，敲低 HOTTIP可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)通過(guò)靶向SGK1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[36]。PRNCR1在結(jié)直腸腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織[37]。BANCR在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，并具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[38]。UCA1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯高于對(duì)照組，其作為潛在的分子病因?qū)W標(biāo)志物，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過(guò)程，對(duì)腫瘤的早期診斷和治療具有潛在的重要價(jià)值[39]。LncRNA-CCAL可通過(guò)靶蛋白AP-2α調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程，并激活Wnt/β-catenin通路。LncRNA-PCAT1與結(jié)直腸癌預(yù)后密切相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)生存期[40]。

4 EMT

EMT是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程[41]。EMT被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[42]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT 時(shí)，細(xì)胞的骨架發(fā)生重組，上皮細(xì)胞表型缺失，增強(qiáng)細(xì)胞間黏附的蛋白如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、橋粒蛋白(desmoplakin，DP) 、閉鎖小帶蛋白-1(zonulaoccludens-1，ZO-1) 、緊密連接蛋白Claudin等表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)志物如波形蛋白(Vimentin) 、纖維黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N) 、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs) 及N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 等表達(dá)增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞之間黏附能力下降或喪失，細(xì)胞間連接松散、失去極性，獲得更強(qiáng)的游走、抗凋亡及降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，這是腫瘤發(fā)生周圍組織侵襲及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)過(guò)程[43]。

目前,對(duì)腫瘤EMT的調(diào)控機(jī)制仍不明確,根據(jù)已有的研究表明,TGF-β、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、IL-6/STAT3以及NF-κB等信號(hào)通路可誘導(dǎo)EMT進(jìn)程。EMT中所涉及的重要轉(zhuǎn)錄因子有:Snail1、Snail2、Twist1、Twist2、ZEB1和ZEB2等[44-45]。通過(guò)檢測(cè)與EMT相關(guān)的經(jīng)典標(biāo)志物在惡性腫瘤中的表達(dá)，從而明確其在惡性腫瘤預(yù)后中的作用，并試圖從中選出關(guān)鍵的分子，以篩選具有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者群體，為患者的預(yù)后判斷、轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)、個(gè)體化治療等方面提供有效的證據(jù)。目前已有的研究顯示EMT與乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種癌癥的原發(fā)浸潤(rùn)和繼發(fā)轉(zhuǎn)移都有著密切聯(lián)系[17,46-47]，但其具體發(fā)生機(jī)制還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。在惡性腫瘤中EMT發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

5 LncRNA與EMT

ncRNA可通過(guò)內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)miRNA，調(diào)控與EMT相關(guān)的一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而影響EMT進(jìn)程，最終改變癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[48]。Dou等[49]建立了Hotair表達(dá)沉默的裸鼠腸癌尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型，與對(duì)照組相比，Hotair敲低后，腸癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移灶減少。研究表明，Hotair通過(guò)參與結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT事件，促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此外，近期研究表明，MALAT1在甲狀腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)異常，參與到EMT過(guò)程中。

由此可見(jiàn)，LncRNA的表達(dá)對(duì)EMT起著重要的調(diào)控作用。但LncRNA調(diào)節(jié)EMT的機(jī)制十分復(fù)雜，且研究尚少，在未來(lái)的研究當(dāng)中，研究者們致力于探尋更多與腫瘤EMT相關(guān)的LncRNA，探索其具體發(fā)生機(jī)制，將為L(zhǎng)ncRNA診斷治療腫瘤開(kāi)辟更寬的路徑。

綜上所述，LncRNA和EMT在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系逐漸受到重視，但其分子機(jī)制研究尚處于初級(jí)階段，LncRNA通過(guò)信號(hào)通路激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)，影響上皮及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，調(diào)控EMT過(guò)程，但仍有大部分LncRNA在腫瘤中與EMT的關(guān)聯(lián)及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LncRNA的深入研究可以為結(jié)直腸癌及其他惡性腫瘤的特異性治療提供線索，有望成為腫瘤診斷及治療的新靶點(diǎn)。