慢性Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液中納米細(xì)菌的檢測

楊 彬，王靖宇，郭 強(qiáng)，張文瑾，袁 帥，張雁鋼

（山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院，山西太原030032）

慢性前列腺炎是泌尿科門診的最常見病之一，其中Ⅲ型前列腺炎（CPPS）占前列腺炎的90%以上，常規(guī)檢測只發(fā)現(xiàn)部分患者存在感染證據(jù)，而部分患者又合并結(jié)石和鈣化，其確切病因至今存在許多學(xué)說［1]，在是否使用抗生素等治療方法上更是方案眾多，缺乏規(guī)范。近來發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌的存在與Ⅲ型前列腺炎有密切關(guān)系，一些患者前列腺液中檢測出納米細(xì)菌（NB）［2]。納米細(xì)菌不僅可以引起炎癥，而且有鈣化作用，與部分前列腺炎患者病變情況相似。本研究通過對臨床78例Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液進(jìn)行檢測，了解其具體感染情況。1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年12月-2016年12月在本院泌尿外科門診經(jīng)Meares-Stamey四杯法篩選的78例Ⅲ型前列腺炎患者，年齡21～44歲，平均30.5歲，病程6～36個(gè)月，均符合美國國立衛(wèi)生院（NIH）制定的前列腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［1]。共同具有以下臨床特征：盆腔區(qū)域疼痛或不適至少持續(xù)3個(gè)月以上，可伴排尿和性功能癥狀，前列腺局部可為炎性或非炎性，前列腺液WBC增高或正常，尿常規(guī)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：前列腺增生、前列腺癌、尿道結(jié)核、泌尿系結(jié)石等以及有嚴(yán)重內(nèi)科等疾患，1 w內(nèi)未服用抗生素。75例正常健康男性的前列腺液作為正常對照。用尿道口消毒后行前列腺按摩，取1～2mL前列腺液（EPS）無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本處理 每份EPS標(biāo)本用生理鹽水稀釋5倍，使用0.45m濾器過濾，離心后取管底1mL加入5mL生理鹽水再次充分稀釋，使用0.22 m濾器再次過濾，離心后取管底1 mL作為成前列腺液檢測原液。之后分別進(jìn)行培養(yǎng)、間接免疫熒光染色及PCR擴(kuò)增。

1.2.2 納米細(xì)菌的培養(yǎng) 取上述制備的檢測原液200μL加入3～4mL含無菌處理的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 w，用相同的RPMI 1640作陰性對照。培養(yǎng)中嚴(yán)格注意操作技術(shù)，定期觀察并記錄細(xì)菌的生長情況。

1.2.3 納米細(xì)菌的鑒定 分別利用下述二種方法進(jìn)行鑒定：①間接免疫熒光染色（IIFS）：將1滴檢測原液滴到透明玻片后自然晾干，用4%多聚甲醛固定15min，滅菌水洗后 70℃10min。滴加一抗（鼠抗納米細(xì)菌單克隆抗體8D10）0.1 mg/mL，37℃孵育60min，PBS沖洗3次。滴加二抗（FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG）0.03mg/mL，37℃孵育40min，再次沖洗3次，2min/次。80%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。②PCR檢測：將上述制備的檢測原液鹽酸處理后，加入Tris堿中和，離心后沉淀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)納米細(xì)菌16sRNA基因序列合成一對引物：5′-aacgaacgactgggggcggcaggc-3′，5′-caccccagtcgctgaccc-3′。反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL，Taq酶（Takara）1 μL，總體系 301 μL，進(jìn)行PCR。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)液觀察結(jié)果

培養(yǎng)2 w后部分培養(yǎng)管底部出現(xiàn)緊貼管壁的白色沉淀，部分培養(yǎng)管下部出現(xiàn)渾濁。繼續(xù)培養(yǎng)和觀察至4 w，10例肉眼可見為沉淀于管底的白色物，15例可見白色或淺黃色絮狀物。而其余53例、正常男性對照和對照的RPMI 1640組中均未觀察到沉淀或絮狀物。取少量沉淀或絮狀物常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡觀察未見典型細(xì)菌或真菌。

2.2 納米細(xì)菌的鑒定

①間接免疫熒光染色法檢測結(jié)果：8D10是小鼠的抗納米細(xì)菌單克隆抗體，可以與納米細(xì)菌發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡觀察可見綠色的球桿狀或球狀顆粒，表明陽性結(jié)果，提示有納米細(xì)菌。78例樣本納米細(xì)菌IIFS法檢測有31例為陽性，其陽性檢出率為39.7%，正常男性對照組無陽性。②PCR法檢測結(jié)果：利用PCR法擴(kuò)增檢測納米細(xì)菌特異性16sRNA基因，目標(biāo)基因大小為1406 bp，因此在1 400 bp左右見陽性可見特異性條帶。78例樣本中有37例納米細(xì)菌PCR檢測陽性，其陽性檢出率為47.4%，正常男性對照組有5例為陽性，其陽性檢出率為6.7%。與IIFS比較，PCR 法的陽性檢出率高（P＜0.05）。

3 討 論

慢性前列腺炎是泌尿科門診的最常見病之一，其病因至今仍不清楚，其診治已成為國際泌尿界的難題。其中Ⅲ型前列腺炎（CPPS）占前列腺炎的90%以上。其特殊性有：①雖然常規(guī)檢查及培養(yǎng)無菌，但前列腺確實(shí)存在炎癥或炎癥標(biāo)記物陽性；②前列腺中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)結(jié)石或鈣化；③多數(shù)抗生素治療能夠取得一定效果，但難以治愈。這些特點(diǎn)提示我們可能有不被認(rèn)知的感染性病因存在。另一方面，由于前列腺炎患者人數(shù)非常眾多，目前診療存在大量誤區(qū)，主要有：①過度診斷：某些醫(yī)療機(jī)構(gòu)和醫(yī)生出于贏利目的，將多數(shù)不相關(guān)的疾病和癥狀（如勃起功能障礙、早泄、精液不液化、弱精子癥等）盲目冠以“前列腺炎”，既增加了患者的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，也延誤了原發(fā)疾病的治療；②過度治療：其中主要為大量、長期、反復(fù)地盲目使用抗生素，結(jié)果是耐藥細(xì)菌越用越多，費(fèi)用高昂，而病情仍未緩解。因此如何明確前列腺炎的發(fā)病機(jī)制，使治療“有的放矢”是目前前列腺炎診治的關(guān)鍵問題所在。

納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)及其致病特點(diǎn)為闡明前列腺炎的病因提供了全新的切入點(diǎn)，納米細(xì)菌為近年發(fā)現(xiàn)的能通過100 nm濾菌器的特殊革蘭陰性菌，能引起組織的炎癥。1992年Kajander EO在一種具有細(xì)胞毒作用的生物膜發(fā)現(xiàn)了一種革蘭染色陰性的顆粒，這些顆粒被命名納米細(xì)菌［3]。這是一種球桿狀或球狀微小病原，基因序列為16sRNA，廣泛地存在于人體內(nèi)，前列腺、尿液、血液及其他許多器官系統(tǒng)已證實(shí)存在納米細(xì)菌。納米細(xì)菌多數(shù)處于一種類休眠狀態(tài)，周圍形成鈣化殼包繞，可以有效對抗機(jī)體免疫細(xì)胞的識別和普通抗生素的殺滅，表現(xiàn)為正常機(jī)體產(chǎn)生的一種鈣化物，因此納米細(xì)菌可以在體內(nèi)長期持續(xù)存在。只有當(dāng)一定條件下納米細(xì)菌分解其具有毒性生物膜時(shí)，才會(huì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)開始識別，出現(xiàn)復(fù)活后的細(xì)菌炎性反應(yīng)。人體泌尿道排泄是納米細(xì)菌的主要出路，除四環(huán)素類外大多數(shù)抗生素對納米細(xì)菌不敏感。本試驗(yàn)利用不同方法對CPPS患者前列腺液中納米細(xì)菌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌在Ⅲ型前列腺炎患者中存在較高的陽性率，推斷其是引起前列腺組織炎性改變的重要原因。

納米細(xì)菌生長非常緩慢，每次繁殖需要3 d左右，4 w左右才能得到培養(yǎng)結(jié)果，因此常規(guī)培養(yǎng)如同結(jié)核桿菌等一樣非常耗時(shí)，影響指導(dǎo)臨床診斷和治療，需要準(zhǔn)確和快捷的手段來協(xié)助前列腺炎的診治。目前研究者公認(rèn)抗納米細(xì)菌單克隆抗體8D10可以結(jié)合納米細(xì)菌外膜特異的糖多肽和通道蛋白，具有特異性并用于納米細(xì)菌的鑒定［4－5]。另外間接免疫熒光法也是公認(rèn)的納米細(xì)菌鑒定基準(zhǔn)，直接鑒定陽性率較低，而培養(yǎng)后間接免疫熒光鑒定可以明顯提高陽性率，但培養(yǎng)同樣需要4 w時(shí)長［6]。因此本研究選擇通過培養(yǎng)、間接免疫熒光法和PCR法，檢測Ⅲ型前列腺炎患者前列腺液中納米細(xì)菌，間接免疫熒光法檢出率較低，PCR檢測納米細(xì)菌16 s rRNA基因的陽性率提高［7]。PCR技術(shù)由于其高敏感性和準(zhǔn)確性，常用于培養(yǎng)周期長和數(shù)量微少的病原微生物，如衣原體、支原體和結(jié)核桿菌。PCR法檢測納米細(xì)菌感染比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法能大幅度減少檢測時(shí)間，給患者提供及時(shí)對癥治療，而相比培養(yǎng)前間接免疫熒光法檢測的敏感性明顯提高，減少了納米細(xì)菌漏診，綜合評價(jià)PCR是一種快捷有效和準(zhǔn)確的檢測手段，對于Ⅲ型前列腺炎納米細(xì)菌感染的判斷具有重要價(jià)值。