不同負荷運動訓(xùn)練對慢性心力衰竭大鼠心功能及自噬相關(guān)蛋白表達的影響

潘月順 仇琪

1天津商業(yè)大學(xué)體衛(wèi)部（天津300134）

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院臨床藥理中心（北京 100029）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心肌病和冠心病等多種心血管疾病的終末階段?；颊哌\動能力顯著下降是CHF的重要臨床表現(xiàn)。隨著心血管康復(fù)運動的不斷發(fā)展，越來越多的臨床研究表明，運動康復(fù)能夠顯著改善輕、中度心功能不全患者[左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＞30%]癥狀[1]，但其具體機制尚未明確。有研究認為，自噬參與了心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程[2]。也有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)強度的運動訓(xùn)練對自噬的激活有助于運動能力的提高[3]。自噬在心力衰竭患者運動康復(fù)過程中似乎起到了雙刃劍的作用。因此，研究不同運動負荷下，心力衰竭模型動物心功能的改善幅度和自噬相關(guān)細胞因子的表達變化情況，對于心力衰竭患者運動強度的選擇和相關(guān)機制探討均具有重要的臨床價值。本研究以左冠狀動脈前降支（left anteriordescending coronary artery，LAD）結(jié)扎法復(fù)制大鼠CHF模型，觀察運動療法對模型動物心功能的影響，并從細胞自噬角度探討其機制，為CHF運動療法的負荷選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級健康雄性SD大鼠40只，體重220±10 g，購于北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)地點北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，飼養(yǎng)溫度23℃ ±2℃，環(huán)境相對濕度40%±5%，通風(fēng)良好，12 h晝夜交替，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。實驗符合《北京市實驗動物管理條例》要求。

1.1.2 試劑和儀器

戊巴比妥鈉（Sigma公司，分析純）；BCA 法蛋白定量試劑盒、Western-blot相關(guān)試劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）[4]；組織樣本處理所需蛋白酶抑制劑（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Anti-mTOR antibody（abcam，USA.Ab2732）；Anti-mTOR （phospho S2481） antibody[EPR427（N）]（ab137133）；Anti-LC3B antibody（ab48394）；Anti-GAPDH antibody（abcam，USA.ab9485）。

小動物呼吸機（Kent Scientific 325）；十二道自動分析心電圖機（FX-8322）；電子天平（CP225D 型）；小動物高分辨率超聲成像系統(tǒng)（Vevo2100，加拿大 VisualSonic公司，30MHz探頭，固定聚焦深度12.7 mm，配備VIVO STRAIN分析軟件）；圖像分析系統(tǒng)（Olympus）；恒溫水浴系統(tǒng)（Multi Temp Ⅲ cooling，Pharmacia Biotech）；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（Bio-RadMiniIII）；振蕩器（HY-5 型）；平板式掃描儀（Umax2100L）；動物跑步機（DB030）。

1.2 造模方法

LAD致CHF大鼠模型的建立方法同課題組前期發(fā)表文章[4]。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，備皮。呼吸機參數(shù)為：呼吸頻率80次/min，潮氣量3 ml/kg，吸呼比1∶2。沿第3、4肋間開口，暴露心臟后，于左心耳邊緣下1 mm進針，行LAD術(shù)。結(jié)扎后，利多卡因注射液心肌表面給藥1～2滴，呋塞米注射液腹腔給藥0.1～0.2 ml后逐層關(guān)胸。術(shù)后青霉素注射液腹腔給藥，800萬單位，每日3次，連續(xù)3天。根據(jù)《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》，射血分?jǐn)?shù)＜50%是診斷心力衰竭的重要指標(biāo)之一[6]。本研究在LAD術(shù)后4周末，行心電圖和超聲心動檢查，標(biāo)準(zhǔn)12導(dǎo)聯(lián)心電圖中出現(xiàn)6～8個導(dǎo)聯(lián)Q波、且LVEF 30%～50%的32只模型大鼠入選后續(xù)實驗。

1.3 分組及運動方案

分組及跑臺訓(xùn)練方案參照Bedford[5]的運動負荷標(biāo)準(zhǔn)制定，與本研究前期發(fā)表文章相同[4]。隨機分為4組，每組8只，具體如下：（1）C+LAD組為模型對照組，不疊加運動訓(xùn)練；（2）模型+低強度運動訓(xùn)練（LE+LAD）組：70%VO2max：跑臺坡度3°，30 m/min×12 min/次×3次；（3）模型+中等強度運動訓(xùn)練（ME+LAD）組：80%VO2max：跑臺坡度6°，32 m/min ×12 min/次×3 次；（4）模型+高強度運動訓(xùn)練（HE+LAD）組：90%VO2max：跑臺坡度6°，36 m/min×12 min/次×3次。所有運動組動物于術(shù)后第5周開始運動，12 min/次，每次間歇30 min，3次/日，每周運動5天。所有動物于運動訓(xùn)練開始后第8周末取材。

1.4 超聲心動評價各組大鼠心功能

為評價運動訓(xùn)練對大鼠心功能的影響，各組大鼠在接受不同強度運動訓(xùn)練8周后進行心臟超聲檢查。大鼠超聲檢查采用Vevo 2100小動物高分辨率超聲成像系統(tǒng)（Visualsonics公司，加拿大），大鼠探頭MS-250，頻率30 MHz，固定聚焦深度12.7 mm，數(shù)據(jù)分析采用配套VIVO STRAIN軟件。所有動物均空腹?fàn)顟B(tài)檢查，麻醉后左側(cè)臥位，動態(tài)圖像觀測與瞬時停禎結(jié)合，采集二維、M型及多普勒超聲心動圖。檢測左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸收縮率（fraction shortening，F(xiàn)S），評價心肌收縮、舒張功能。

1.5 Western-blot實驗

方法與課題組前期發(fā)表文章相同[4]。簡述如下，取左心室梗死邊緣區(qū)0.5mm以內(nèi)心肌組織50 mg，提取總蛋白，BCA法進行蛋白含量測定后，每孔上樣50 μg，采用濃縮膠5%～7%，分離膠10%或12.5%。電泳條件：100 V，1.5 h。轉(zhuǎn)膜條件：300 mA，1～1.5 h，5%脫脂奶粉4℃封閉1h。一抗條件：兔抗大鼠雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）多克隆抗體1∶1000；兔抗大鼠磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體1∶1000；兔抗自噬相關(guān)蛋白LC3B（microtubuleassociated protein light chain 3B，LC3B）多克隆抗體1∶1000；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體1∶1000。孵育過夜后0.1%TBST漂洗NC膜3×15 min。二抗條件：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000），37℃孵育1.5 h，TBST漂洗3×15 min。滴加ECL發(fā)光液，曝光。掃描膠片后，使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，與內(nèi)參（GAPDH）條帶光密度值進行比較后，得到目的蛋白表達的相對光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Spss22.0軟件進行統(tǒng)計分析。分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動評價結(jié)果

與C+LAD組比較，ME+LAD組大鼠FS和EF均顯著升高（P＜0.01），LE+LAD組FS顯著改善（P＜0.05）；ME+LAD組大鼠FS值顯著高于HE+LAD組（P＜0.01），EF值顯著高于HE+LAD組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠運動后8周心功能比較（n=8，%）

2.2 心肌細胞自噬相關(guān)蛋白表達情況

與C+LAD組比較，LE+LAD組和ME+LAD組大鼠心肌組織mTOR表達降低（P＜0.05，P＜0.01），ME+LAD組和HE+LAD組大鼠心肌組織p-mTOR表達降低（P＜0.01），LC3B-Ⅱ表達升高（P＜0.01）。與 LE+LAD組相比，ME+LAD組和HE+LAD組大鼠心肌組織p-mTOR表達降低、LC3B-Ⅱ表達升高（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達水平

表2 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白條帶分析結(jié)果

3 討論

心衰是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，死亡率和再住院率居高不下[6]。冠心病導(dǎo)致的心肌缺血是CHF最主要的誘因。在CHF的臨床治療和康復(fù)過程中，心功能改善程度是判斷治療效果的重要指標(biāo)。國內(nèi)相關(guān)臨床研究表明，運動療法能通過減輕患者心臟負荷、降低外周血管阻力，減少心肌耗氧量，增強心肌收縮力，提高心排出量，有效促進CHF患者心功能和生活質(zhì)量的改善[7-9]。國外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練能夠激活骨骼肌自噬水平，改善心梗大鼠心功能[10]。本研究結(jié)果顯示，與C+LAD組大鼠心功能相比，不同負荷訓(xùn)練對模型動物的心功能表現(xiàn)為EF和FS值的不同程度改善。其中，以ME+LAD組大鼠EF和FS值升高最為顯著。上述動物在體實驗結(jié)果進一步驗證了運動療法對心力衰竭動物心功能的改善作用。與此同時，心力衰竭模型的成功復(fù)制為運動療法的機制研究提供了可能。為探討運動療法實現(xiàn)心功能改善的可能機制，本研究以心肌細胞自噬相關(guān)細胞因子的表達為靶點，進行了較為深入的研究。

自噬是真核細胞通過溶酶體機制降解自身成分的一種代謝途徑。細胞通過自噬降解損壞的細胞器和大分子延長細胞壽命。依賴于激活的時間、幅度和細胞類型，自噬過程在多種心血管疾病中表現(xiàn)出雙重作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，適宜強度的運動可能會上調(diào)心肌細胞自噬水平，促進細胞內(nèi)代謝廢物降解，引起心肌組織細胞良好的適應(yīng)性重塑，幫助維持心肌細胞自身穩(wěn)態(tài)[12]。但大強度長時間的耐力訓(xùn)練可能會引起心肌細胞形態(tài)異常，它可能導(dǎo)致線粒體巨變和自噬體增多、細胞內(nèi)成分過度降解，進而導(dǎo)致心肌細胞死亡，從而形成心肌損傷的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。本研究根據(jù)不同運動負荷對心衰模型動物進行分組訓(xùn)練，希望能夠發(fā)現(xiàn)不同負荷運動對大鼠心肌細胞自噬水平的影響。

mTOR已被明確為自噬的負性調(diào)控因子。有研究認為，在病理性心肌肥厚形成及心力衰竭進展過程中，通過抑制 mTOR信號通路，阻斷其調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)合成，提高自噬水平，可以減弱心肌肥厚，延緩心力衰竭進展[14]。LC3B也是自噬的關(guān)鍵蛋白，在自噬泡形成過程中參與兩種泛素樣蛋白系統(tǒng)的加工過程，被認為是自噬活動的特異性標(biāo)志物，缺血區(qū)域周圍的心肌細胞LC3B-Ⅱ水平的顯著升高也表明了該區(qū)域心肌細胞自噬的激活[15，16]。Moradi等研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運動聯(lián)合飲食控制能夠上調(diào)LC3B-Ⅱ水平，抑制心衰大鼠的左心室重構(gòu)[17]。但目前針對心衰模型動物心肌細胞自噬水平與不同負荷運動訓(xùn)練之間關(guān)系的研究，尚未見報道。因此，本研究將上述指標(biāo)相結(jié)合，對不同負荷運動后大鼠心肌細胞的自噬水平進行判斷。結(jié)果表明，LE+LAD組的運動負荷程度不足以激活心肌細胞自噬，ME+LAD組和HE+LAD組訓(xùn)練均能夠顯著抑制mTOR及其磷酸化水平，同時，LC3B-Ⅱ/GAPDH 水平也發(fā)生了不同程度的提高?？梢姡?、高負荷的運動訓(xùn)練能夠激活心衰大鼠心肌細胞自噬水平，而且運動負荷越大，心肌細胞自噬水平越高。

然而，本研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活水平最高的HE+LAD組大鼠心功能并未得到顯著改善。結(jié)合前期文獻報道和本課題前期研究結(jié)果[4]分析原因認為，高負荷運動訓(xùn)練可能導(dǎo)致了心肌細胞自噬的過度激活，同時導(dǎo)致了心肌細胞凋亡水平的升高，而中等負荷的運動訓(xùn)練則在心肌細胞的自噬與凋亡之間形成了良好的平衡，從而對心功能的恢復(fù)起到了積極作用，進一步證實了心衰的運動康復(fù)過程中運動負荷選擇的重要性。

4 結(jié)論

適度運動能夠改善心力衰竭大鼠心功能，這種心功能的改善可能與抑制mTOR和其磷酸化水平，提高LC3B-Ⅱ水平，適度激活心肌細胞自噬有關(guān)。