基于核磁共振技術研究高強度間歇訓練對大鼠血清代謝組學的影響

高浩恩 艾競一 李方暉 孫磊

南京師范大學體育科學學院（江蘇南京 210046）

高強度間歇訓練（high-intensity intervals training，HIIT）是以無氧閾或最大乳酸穩(wěn)態(tài)的負荷強度進行多次持續(xù)時間為幾秒到幾分鐘的練習，且每兩次練習之間安排使練習者不足以完全恢復到靜息的訓練方法[1]。業(yè)已證實，HIIT對于提高運動員的運動成績、提升健康人群有氧適能、改善心血管病和2型糖尿病患者的心肺耐力優(yōu)于傳統(tǒng)中等強度持續(xù)性訓練（moderate-intensity continuous training，MICT）[2，3]。文獻表明，與相同運動強度的MICT相比，HIIT能更有效的提高骨骼肌氧化代謝活性[4]、增強心肌收縮功能和耗氧應答速率[5]、促進骨骼肌和心肌線粒體生物合成、改善機體抗疲勞能力[6]和自我效能感[7]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，HIIT對有氧耐力的提高與骨骼肌丙酮酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶、葡萄糖轉運蛋白4、脂肪酸轉運酶、單羧酸轉運體蛋白、檸檬酸合酶等蛋白表達增加有關；HIIT也能增強骨骼肌無氧代謝能力、峰值功率[8]和反復沖刺能力[6]，這可能與血清中磷酸肌酸含量增加、骨骼肌糖酵解的限速酶磷酸果糖激酶活性增強有關[9，10]。

基于核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）的非靶向代謝組學技術被廣泛應用于體能訓練監(jiān)控、疾病運動療法機制和體適能水平表征等運動科學的熱點問題研究，有學者將其定義為“運動代謝組學”[11]。值得注意的是，已有文獻報道了急性高強度間歇訓練對血清代謝表型的影響[12]，但未見長期HIIT誘導血清代謝表型適應性改變的文獻報道?；诖耍狙芯坎捎肗MR技術對10周MICT和HIIT訓練后大鼠血清進行代謝指紋圖譜數(shù)據(jù)采集，通過分析比較這兩種訓練模式下差異代謝產(chǎn)物的改變來揭示內(nèi)源性代謝途徑的變化，旨在為HIIT更好的應用于競技體育和運動健身領域中提供數(shù)據(jù)支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級雄性8周齡SD（Sprague Dawley）大鼠34只，體重369.00±24.10 g，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供。動物許可證號:SCXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)室溫度為23.00℃±1.50℃，相對濕度45% ±15%。動物房保持自然照明。所有大鼠在適應性喂養(yǎng)1周后被隨機分為安靜對照組（SC組，n=10），MICT組（n=12）和HIIT組（n=12），共3組。

1.2 運動訓練方案

根據(jù)漆正堂等[10]的方法制定跑臺方案。MICT和HIIT組大鼠在適應性喂養(yǎng)1周開始進行為期2周的跑臺（廣州飛迪生物科技有限公司動物實驗跑臺，型號FD000043）適應性訓練。第1周跑速10～15 m/min，每天運動30 min，第2周20 m/min，每天30～40 min，每周5天，周六、周日休息。適應性訓練后進行正式訓練。MICT方案：以18 m/min速度（40%～50%VO2max）[13]熱身3 min，之后以28 m/min速度（70%VO2max）[9]持續(xù)運動34 min，隨后再以18 m/min速度放松3 min。HIIT方案：以18 m/min運動5 min，再以42 m/min（95%～99%VO2max）[13]運動4 min，之后依次交替進行，重復4次，最后以速度為14 m/min放松2 min。運動均1次/天，5天/周，周六、周日休息，共10周。SC組大鼠不進行跑臺訓練。

1.3 耐力測試

各組大鼠的力竭時間（time to exhaustion）和跑步距離（running distance）在末次訓練后第2天進行測試。方案[13]：進行10 min跑臺熱身運動（速度5 m/min）后，起始負荷設定為10 m/min，每3 min遞增5 m/min，直到力竭。力竭判定標準：動物跟不上預定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉動皮帶后拖達30 s，毛刷刺激驅趕無效；行為特征表現(xiàn)為呼吸深急，精神疲倦，俯臥位垂頭，刺激后無反應。記錄力竭時間，并計算跑步距離。

1.4 血清取樣及組織分離處理

在耐力測試后48 h稱重，按照4 ml/kg劑量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，腹主動脈采血。每只大鼠采血1.5 ml放入5 ml EP管中，常溫靜置30 min，然后4℃靜置1小時，離心15 min，轉速為3500 rpm，取上清液分裝于凍存管中密封，轉移至-80℃低溫冰箱凍存，待代謝組學測試分析。迅速分離比目魚肌、腓腸肌、股四頭肌、趾長伸肌、腎周脂肪、睪丸并稱重，計算各組織相對重量（%）=各組織重量（g）/體重（g）×100%。

1.5 核磁共振波譜分析

1.5.1 樣品采集與制備及測定條件

從各組血清樣本中隨機選取7個樣本用于NMR譜采集和血清代謝組學分析。常溫解凍樣本，渦旋樣本30 s；離心樣本5 min（4℃，13000 rpm）；超濾膜離心過濾45 min后離心樣本5 min（4℃，13000 rpm）；取澄清透明的濾液于新編號離心管，加入重水稀釋至500 μl，渦旋10s；離心分離2 min（4℃，13000 rpm）；取480 μl上層清液于NMR管中，600 MHz NMR（25℃）譜儀采集核磁波譜圖。

1.5.2 NNMMRR譜圖數(shù)據(jù)處理與分析

將NMR自由感應衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號導入 Chenomx NMR suit（version 8.1，Chenomx，Edmonton，Canada）軟件，自動進行傅立葉轉換，調整相位，校正基線，以DSS（δ0.00）處雙峰中心作為全部譜圖化學位移的標準。對0.01～10.00 ppm范圍內(nèi)譜峰進行分析，以0.04 ppm單位的化學位移為分段積分單元。為了防止水的殘留峰干擾，除去4.65～5.05 ppm（水峰）處的分段積分值。然后將所有積分值的面積進行歸一化處理，導出到Excel表格中，得到每個分段和對應的積分面積值矩陣。將上述處理的積分數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 13.0（Umetrics，Sweden）軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA），再用偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）找出樣品間差異代謝產(chǎn)物。PCA和PLSDA分析方法具體參見文獻[12]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，Graph Pad Prism（Version 6.07）軟件作圖。對各組大鼠體重和組織重量采用單因素方差分析和多重比較檢驗；差異代謝產(chǎn)物采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson相關計算跑步力竭時間與膽堿和酪氨酸相關系數(shù)，相關系數(shù)用r表示。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，顯著差異選擇P＜0.05和P＜0.01水平。

2 結果

2.1 各組大鼠最終體重、相關組織重量及其相對重量

表1顯示，與SC組相比，HIIT和MICT組大鼠最終體重、腎周脂肪重量和腎周脂肪相對重量顯著降低（P＜0.01），睪丸相對重量顯著性增加（P＜0.01）；與SC組相比，MICT組股四頭肌相對重量和腓腸肌相對重量分別增加12.10%（P＜0.05）和21.80%（P＜0.01）；與SC組相比，HIIT組股四頭肌相對重量和腓腸肌相對重量分別增加10.60%（P＜0.05）和14.60%（P＜0.01），但股四頭肌和腓腸肌重量分別減少15.60%（P＜0.05）和19.20%（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠跑步距離和力竭時間

如圖1所示，與SC組相比，MICT組大鼠跑步距離（圖1A）和力竭時間（圖1B）分別增加1.32倍（P＜0.01）和1.28倍（P＜0.01），HIIT組也分別增加1.45倍（圖1A，P＜0.01）和2.33倍（圖1B，P＜0.01）；與MICT組比較，HIIT組跑步距離（圖1A）和力竭時間（圖1B）分別增加21.50%（P＜0.05）和1.05倍（P＜0.05）。

表1 各組大鼠最終體重、相關組織重量及其相對重量

圖1 各組大鼠跑步距離（A）和力竭時間（B）

2.3 各組大鼠血清基于NMR代謝組學技術的圖譜

圖2顯示NMR代謝指紋圖譜，橫坐標為化學位移（單位：ppm）。鑒于譜峰的積分面積與代謝產(chǎn)物的濃度呈正相關，可通過對譜峰進行積分做相應代謝產(chǎn)物的定量分析。由于每一個代謝產(chǎn)物在相同緩沖液中出峰位置固定，即化學位移（δ）是固定的，結合每個代謝物化學位移、裂峰及偶合常數(shù)，參照文獻和數(shù)據(jù)庫對圖譜進行指認。圖2標注了三組大鼠血清代謝指紋圖譜中有重要貢獻的差異代謝物歸屬。

2.4 各組大鼠血清樣本PCA分析

圖3表示采用PCA對SC與MICT組、SC與HIIT組、MICT與HIIT組的血清樣本進行NMR代謝輪廓分析。結果顯示，SC與MICT兩組血清樣本得分圖有簇類分布，提取的主成分1（PC1）和主成分2（PC2）各占66.5和14.4%（圖3A）；SC與HIIT兩組也具有簇類分布，PC1和PC2各占62.9和14.2%（圖3B）；MICT和HIIT兩組的簇類分布不明顯，無法得到分離（圖3C）。

2.5 各組大鼠血清樣本代謝物PLS-DA分析

PCA作為無監(jiān)督分析方法，僅能反映數(shù)據(jù)原始狀態(tài)，但在實驗過程中環(huán)境、飲食及實驗系統(tǒng)誤差均會影響分析結果。為了明確兩種訓練方式對大鼠血清代謝表型改變的特異性，本研究采用監(jiān)督判別分析PLS-DA對SC與MICT組、SC與HIIT組之間的血清樣本代謝物進行判別分析，所得的散點圖見圖4A和圖4C。結果發(fā)現(xiàn)，與PCA結果相似，SC與MICT組、SC與HIIT組的樣本得分圖均有簇類分布。同時，采用R2X（cum）、R2Y（cum）和Q2（cum）3個參數(shù)來檢驗PLS-DA模型穩(wěn)健性，Q2表征模型的可信程度，一般認為Q2值大于0.4可信程度較高；R2X和R2Y表征本模型能解釋變量的百分數(shù)。結果顯示，SC與MICT組Q2為0.46，R2X與R2Y分別為0.20和0.60；SC與HIIT組Q2為0.40，R2X與R2Y分別為0.21和0.61。說明SC與MICT組、SC與HIIT組PLS-DA模型的可信程度基本滿足進一步分析差異代謝物的要求。

為了找出SC與MICT組、SC與HIIT組血清樣本中的代謝差異物，本研究通過PLS-DA得出的變量投影重要性指標（variable importance in projection，VIP）值大小對分類重要的變量進行衡量。VIP值越大，對分組貢獻越大，一般默認VIP值大于等于1的變量具有顯著性差異。結果顯示，在區(qū)分SC與MICT組血清代謝譜中，貢獻大小依次為葡萄糖、乳酸、賴氨酸、谷氨酸、膽堿、谷氨酰胺、3-羥基丁酸（圖4B，僅顯示15個化學位移點）；而在區(qū)分SC與HIIT組血清代謝譜中，貢獻大小依次為葡萄糖、賴氨酸、乳酸、異亮氨酸、3-羥基丁酸、谷氨酰胺、甘油、亮氨酸、膽堿、纈氨酸（圖4D）。

圖2 各組大鼠血清樣本核磁共振波譜特征峰的指認圖

圖3 各組大鼠血清NMR譜PCA得分圖

2.6 差異代謝物的相對濃度改變及膽堿和酪氨酸與力竭時間的相關性

圖5顯示，與SC組相比，MICT和HIIT組大鼠血清葡萄糖顯著降低（P＜0.05，圖5A和圖5B）；MICT組大鼠血清中膽堿、谷氨酰胺、賴氨酸和3-羥基丁酸均高于SC組（P＜0.05，圖5A），HIIT組大鼠血清中膽堿、3-羥基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸和纈氨酸均高于SC組（P＜0.05，圖5B）；相關分析顯示，HIIT和SC組大鼠血清膽堿（r=0.65，P＜0.05，圖5C）和酪氨酸（r=0.81，P＜0.01，圖5D）與力竭時間分別呈顯著性和極顯著正相關;MICT和SC組大鼠血清膽堿與力竭時間呈顯著性正相關（r=0.57，P＜0.05，圖5E），而MICT和SC組大鼠血清酪氨酸與力竭時間的相關性不顯著（r=0.22，P＞0.05，圖5F）。

圖4 各組大鼠血清1H NMR指紋圖譜的PLS-DA散點圖和VIP圖

3 討論

3.1 HIIT和MICT后大鼠血清代謝組學的適應性改變

動物實驗表明，MICT和HIIT均能降低大鼠體脂百分比，增加骨骼肌相對重量，進而提高大鼠運動耐力水平[9]。本研究也證實這一結論。本文表1顯示，與SC組大鼠相比，MICT組和HIIT組大鼠的最終體重、腎周脂肪重量及其相對重量降低，股四頭肌、腓腸肌及睪丸的相對重量均顯著增加，提示MICT和HIIT導致大鼠的體成分發(fā)生相似的適應性改變。

本研究進一步研究MICT和HIIT對大鼠血清代謝組學的影響。結果顯示，SC與HIIT（圖3B）、SC與MICT組（圖3A）大鼠血清代謝譜PCA得分圖均具有簇類分布，但MICT與HIIT組并無簇類分布（圖3C）。提示，MICT和HIIT導致大鼠血清代謝組發(fā)生明顯改變。然而，僅從PCA中無法區(qū)分MICT和HIIT所引起的代謝表型變化差異，這與Pechlivanis等[14]研究結果一致。Pechlivanis等[14]研究發(fā)現(xiàn)，8周大強度沖刺間歇訓練前后血清代謝組學發(fā)生明顯改變；但間歇期60 s和間歇期10 s在訓練后的血清代謝譜PCA得分圖無簇類分布。

本研究參考Zafeiridis等[15]分析方法，采用PLS-DA分別對SC與MICT組、SC與HIIT組的血清指紋圖譜分別進行建模，所得的代謝產(chǎn)物變量對分類重要程度由VIP值衡量。VIP圖顯示（圖4B），SC與MICT組差異代謝產(chǎn)物包括葡萄糖、3-羥基丁酸、乳酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、膽堿；SC與HIIT組差異代謝產(chǎn)物包括葡萄糖、3-羥基丁酸、乳酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、膽堿和酪氨酸（圖4D）。本文進一步對上述差異代謝物峰面積進行獨立樣本T檢驗后發(fā)現(xiàn)，MICT組3-羥基丁酸、膽堿、谷氨酰胺和賴氨酸均高于SC組（圖5A）；HIIT組支鏈氨基酸（branched-chain amino acids，BCAAs）、3-羥基丁酸、膽堿、谷氨酰胺、酪氨酸均顯著高于SC組（圖5B）；HIIT和MICT組血清中葡萄糖水平均低于SC組。上述差異代謝產(chǎn)物涉及氨基酸、葡萄糖和脂肪酸等代謝產(chǎn)物改變，這與8周沖刺間歇訓練引起的人體血清差異代謝產(chǎn)物的適應性變化相類似[14]。值得指出的是，與MICT組相比，本研究中HIIT組既有相同的代謝傾向，又有其特異性的代謝產(chǎn)物變化。

圖5 差異代謝物的相對濃度改變及膽堿和酪氨酸與力竭時間的相關性

3.2 HIIT和MICT誘導的相同血清代謝產(chǎn)物變化

本文圖5顯示，兩種訓練方式均能導致大鼠血清中谷氨酰胺和膽堿水平顯著增加。與本研究一致的是，Pechlivanis等[14]研究發(fā)現(xiàn)，8周大強度沖刺跑訓練可導致受試者血清代謝表型中的谷氨酰胺和膽堿濃度呈現(xiàn)顯著增加。作為膽堿能神經(jīng)遞質乙酰膽堿生物合成的前體，血清膽堿濃度降低將直接導致中樞系統(tǒng)中乙酰膽堿水平合成、釋放和利用減少，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)調控能力和支配肌肉收縮的神經(jīng)傳導速度下降，進而誘發(fā)運動性疲勞[16]。運動前補充膽堿可通過增加血清中膽堿水平來提高運動員有氧耐力和抗疲勞能力[16，17]。與膽堿類似，補充谷氨酰胺也可提高機體運動成績，這與谷氨酰胺降低肌細胞內(nèi)血氨和緩沖乳酸濃度有關[18]。動物研究證實，長期運動訓練可通過增加小鼠血清代謝表型中谷氨酰胺[19]和膽堿[20]水平提高小鼠運動成績；而谷氨酰胺在跑步耐力強的小鼠血清中高于跑步耐力差的小鼠[19]；Gonzales等[21]的磁共振質子波譜掃描實驗也證實，中等強度運動后中老年男性大腦枕葉灰質區(qū)的膽堿含量明顯高于安靜對照組，且與受試者VO2max呈正相關。本研究也證實，HIIT和SC組大鼠血清膽堿（r=0.65，P＜0.05，圖5C）與力竭時間分別呈顯著性正相關，MICT和SC組大鼠血清膽堿（r=0.57，P＜0.05，圖5E）與力竭時間也呈顯著正相關，提示血清膽堿可作為上述兩種訓練方式提高大鼠耐力成績的共同代謝標示物。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HIIT和MICT組大鼠血清中的3-羥基丁酸（長鏈脂肪酸不完全氧化的代謝產(chǎn)物）增加的同時，葡萄糖含量顯著減少（圖5A和B）。業(yè)已證實[22]，3-羥基丁酸可作為高效的能量底物為骨骼肌和大腦供能，也能通過加速肌糖原生物合成來提高有氧耐力。Pechlivanis等[14]對運動員尿液代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，3-羥基丁酸在急性大強度運動后增加并于1 h達到峰值，但運動后2 h回到基線水平。Huang等[23]在大鼠一次性力竭運動和重復性訓練后，采用傳統(tǒng)生化技術測定也發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酸在血清中增加，而重復性訓練比單次長時間運動更容易促進機體脂肪分解代謝。提示，長期HIIT和MICT均可加速機體脂肪酸代謝，進而減少運動過程對葡萄糖的過度依賴。

此外，血清中的賴氨酸在運動組中也顯著增加（圖5A和B）。賴氨酸作為肉毒堿生物合成的前體物質參與線粒體脂肪酸β氧化過程[24]。研究證實[24]，賴氨酸補充可抑制力竭運動大鼠心臟和肝細胞凋亡，延長力竭時間。Falegan等[19]也證實，跑步能力強的小鼠血清賴氨酸儲備量高于跑步能力弱的小鼠。同樣，Xiang等[25]對健康安靜組、健康耐力運動組、2型糖尿病安靜組和2型糖尿病耐力運動4個組大鼠的血清進行代謝組學分析后也發(fā)現(xiàn)，與健康安靜組相比，2型糖尿病大鼠血清中賴氨酸水平降低，但耐力運動能提高健康大鼠血清中賴氨酸水平，進而改善骨骼肌脂肪酸β氧化速率。Taylor等[26]研究進一步表明，賴氨酸補充能促進小鼠骨骼肌脂肪分解基因表達和骨骼肌糖原的合成，抑制肌細胞內(nèi)脂肪合成過程。綜上可知，HIIT和MICT訓練模式可能通過賴氨酸促進脂肪酸分解，同時也通過增加骨骼肌胰島素敏感性和糖原合成酶蛋白表達來提高大鼠肌糖原含量，使機體能量代謝趨于脂肪酸分解代謝轉變，從而維持運動過程中血糖穩(wěn)態(tài)[19]。

3.3 HIIT誘導特異的血清代謝產(chǎn)物變化

值得指出的是，本文圖5B顯示，BCAAs和酪氨酸兩個代謝產(chǎn)物在HIIT組特異性增加。BCAAs包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸三種具有支鏈碳骨架的氨基酸。大強度運動過程中，BCAAs既可經(jīng)支鏈α酮酸脫氫酶分解并為骨骼肌收縮供能，也能參與肝臟糖異生和肌肉蛋白質合成等過程；血清BCAAs含量降低將引發(fā)蘋果酸/天冬氨酸穿梭、丙氨酸和谷氨酰胺合成降低，導致骨骼肌細胞內(nèi)的血乳酸/丙酮酸比值和氨水平增加，引起骨骼肌收縮機能下降[27]。

作為芳香族氨基酸，酪氨酸是合成兒茶酚胺類神經(jīng)遞質多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的前體，同時也可以通過分解轉變成為延胡索酸和乙酰乙酸進入三羧酸循環(huán)[27]。研究認為[28]，腦內(nèi)多巴胺含量與肌肉協(xié)調能力以及耐力運動成績呈正相關。動物實驗也表明[20]，長期自主轉輪運動和耐力運動也能增加血清代謝表型中酪氨酸含量；跑步耐力強的小鼠血清酪氨酸水平顯著高于跑步耐力弱的小鼠[29]。與本研究結果一致的是，Duft等[27]對22名中年肥胖男子進行24周的力量聯(lián)合耐力訓練后發(fā)現(xiàn)，運動組血清中的酪氨酸和BCAAs濃度均高于對照組，且酪氨酸與受試者VO2max呈正相關?；谇叭搜芯縖20，22，29]和本文圖5的結果提示：酪氨酸和BCAAs可作為HIIT誘導機體代謝適應性變化的特異性標示物，其中酪氨酸代謝變化可能與HIIT組大鼠耐力水平的改善有關（r=0.81，P＜0.01）。

4 總結

4.1 與安靜對照組相比，高強度間歇訓練組和中等強度持續(xù)訓練組相同的差異代謝產(chǎn)物包括葡萄糖、3-羥基丁酸、乳酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、膽堿；支鏈氨基酸和酪氨酸在高強度間歇訓練組大鼠血清中特異性增加，表明長期高強度間歇訓練后機體呈現(xiàn)出與中等強度持續(xù)訓練不同的代謝適應性變化。

4.2 共同差異代謝物中的膽堿與力竭時間呈正相關，表明10周高強度間歇訓練和中等強度持續(xù)訓練對大鼠運動耐力的提升均可能與膽堿代謝改變有關。

4.3 高強度間歇訓練組特異代謝物酪氨酸與力竭時間呈正相關，表明酪氨酸代謝的改變與高強度間歇訓練組大鼠耐力水平增強有關。