8周間歇有氧運動對老齡食源性肥胖大鼠下丘腦LKB1-AMPK信號通路和能量攝入的影響

任華 史嬌嬌 常波

1貴州財經(jīng)大學(xué)體育工作部（貴陽 550025）

2遼寧醫(yī)學(xué)院體育教研部 3沈陽體育學(xué)院運動人體科學(xué)學(xué)院

下丘腦是調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡的高級神經(jīng)中樞，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的攝食行為以及脂肪的分解[1]，在肥胖癥的形成及發(fā)展中起著重要作用。下丘腦5'-單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的營養(yǎng)和葡萄糖傳感器，也是食欲調(diào)節(jié)器[2]。AMPK是一個由α催化亞基，β、γ調(diào)節(jié)亞基組成的異源三聚體，廣泛存在于機(jī)體骨骼肌、肝臟、脂肪及下丘腦等組織中。AMPK只有磷酸化后才具有活性，去磷酸化后則活性喪失。絲/蘇氨酸蛋白激酶11（serine/threonine-protein kinase11，STK11/LKB1）是一種十分重要的AMPK激酶，能夠促使AMPK磷酸化而激活，在缺乏LKB1表達(dá)的細(xì)胞中或在LKB1基因被敲除的嚙齒動物中AMPK不能被激活[3]。AMPK調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的一個機(jī)制是磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA Carboxylase，ACC）從而使其失去活性。ACC是脂肪酸合成過程中的限速酶，也是長鏈脂肪?；o酶A轉(zhuǎn)運至線粒體進(jìn)行β-氧化的抑制劑。Savage研究顯示[4]，ACC1和ACC2基因敲除后脂肪酸持續(xù)氧化分解，增加能量消耗并減少脂肪的攝入。因此，下丘腦LKB1-AMPK信號通路在肥胖癥的形成中起著非常關(guān)鍵的作用。

中小強(qiáng)度的有氧運動是目前治療肥胖的有效方法，有氧運動能夠改善機(jī)體能量代謝，促進(jìn)脂肪的氧化分解。Sriwijitkamol等研究顯示[5]，運動能夠修復(fù)肥胖所引起的肌肉組織AMPK活性的受損。衣雪潔等研究[6-8]同樣發(fā)現(xiàn)，肥胖導(dǎo)致SD雄性大鼠肝臟、脂肪、肌肉等外周組織AMPK活性受損，而經(jīng)過一段時間的有氧運動訓(xùn)練，伴隨著大鼠體重的顯著降低，AMPK活性顯著提高，ACC活性顯著下降。然而，當(dāng)前研究大多集中于肌肉、脂肪、肝臟等外周組織，迄今為止未見肥胖和間歇有氧運動對下丘腦這一機(jī)體能量調(diào)節(jié)的高級中樞組織中LKB1-AMPK信號傳導(dǎo)通路及其能量攝入變化的系統(tǒng)研究。鑒于此，本研究建立飲食誘導(dǎo)的老齡雄性肥胖大鼠模型，觀察8周間歇有氧運動對下丘腦LKB1-AMPK信號通路各因子基因表達(dá)的影響，同時觀察肥胖和間歇有氧運動狀態(tài)下大鼠能量攝入的變化。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組

選用60周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量580±20 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。將動物分籠飼養(yǎng)在環(huán)境溫度22±5℃的鼠籠中，每籠2只，并保持12 h/12 h的明暗周期（每日07:00至19:00給予光照），自由飲食、飲水。

為了讓大鼠適應(yīng)新的飼養(yǎng)環(huán)境，所有大鼠在實驗的第1周自由采食普通飼料和水。然后將大鼠隨機(jī)分為2組：給予普通飼料的普通膳食組（CF組，n=30）和給予高脂飼料的高脂膳食組（HF組，n=30）組。本次實驗所采用的大鼠飼料成分如表1所示。經(jīng)過8周的飲食干預(yù)，HF組大鼠體重超過CF組大鼠平均體重的20%即為肥胖建模成功[9]。本實驗中，共有22只大鼠達(dá)到肥胖大鼠的標(biāo)準(zhǔn)，肥胖造模成功率為73.3%。8周后從CF組大鼠中隨機(jī)選取16只體重正常大鼠，分為普通飼料安靜組（NC組，n=8）和普通飼料運動組（NE組，n=8），繼續(xù)自由進(jìn)食普通飼料和飲水；從HF組肥胖造模成功的大鼠中隨機(jī)選取 16只，分為肥胖安靜組（OC組，n=8）和肥胖運動組（OE組，n=8），繼續(xù)自由進(jìn)食高脂飼料和飲水。每天詳細(xì)記錄各組大鼠食物攝入量（g/day），計算出各組大鼠平均每天的能量攝入量（kcal/day），每周定時（8:00～10:00）稱大鼠體重（g）并觀察大鼠健康狀況。

表1 實驗飼料的組成

1.2 間歇有氧運動方案

NE組和OE組大鼠進(jìn)行間歇性游泳運動訓(xùn)練，為了減輕水誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，首先讓大鼠進(jìn)行為期2天、每天10～20 min的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練。大鼠訓(xùn)練場所為直徑45 cm、水深60 cm的圓形塑料游泳池，水溫34～35℃，每2～3只為一組。間歇有氧運動實驗設(shè)計依據(jù)Luciano等報道的方案[10]（根據(jù)本研究預(yù)實驗結(jié)果稍作調(diào)整），具體訓(xùn)練方案如表2所示。

表2 每周游泳時間與間歇時間（min）

1.3 組織提取

所有組別大鼠在NE組和OE組大鼠最后一次游泳訓(xùn)練后24 h，在硫噴妥鈉（200 mg/kg，NIH推薦）麻醉下，處死大鼠，迅速取下丘腦組織，投入液氮內(nèi)，移入-80°C冰箱進(jìn)行保存，以備RNA提取和實時定量熒光PCR檢測。

1.4 RNA的提取和實時PCR

用RNAiso Plus（Takara，China）提取冷凍下丘腦的總RNA，并在260/280 nm紫外吸收測定濃度。采用PrimeScript RT reagent kit（Takara，China）試劑盒進(jìn)行RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄。用7900HT型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）分析實時定量PCR和后繼的數(shù)據(jù)處理。β-actin表達(dá)不受任何干預(yù)影響，測定βactin水平作為內(nèi)參，β-actin的濃度作為所有mRNA數(shù)據(jù)的相對單位。引物序列見表3。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗所得所有數(shù)據(jù)均用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。統(tǒng)計分析用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，確定NC組與NE組、OC組以及OC組與OE組的組間是否有顯著差異，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 實時PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

如表4所示，8周飼養(yǎng)后，HF組大鼠體重顯著高于CF組（P＜0.01）。8周間歇有氧訓(xùn)練后，NE組大鼠體重顯著低于NC組（P＜0.01），OC組大鼠體重顯著高于NC組（P＜0.01），OE組大鼠體重顯著低于OC組（P＜0.01）。

表4 各組大鼠體重比較（g）

2.2 各組大鼠能量攝入變化

如表5所示，在間歇有氧運動訓(xùn)練的8周里，OC組大鼠平均每天的食物攝入量和能量攝入均顯著高于NC組大鼠（P＜0.01）；而NC與NE組相比、OC組與OE組相比，均無顯著性變化（P＞0.05）。

表5 每組大鼠平均每天食物攝入量和能量攝入比較（n=8）

2.3 各組大鼠下丘腦LKB 1、AMPK、ACC基因轉(zhuǎn)錄情況

如圖1所示，與NC組大鼠相比，肥胖引起OC組大鼠下丘腦LKB1、AMPKα1、AMPKα2的基因表達(dá)均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），ACC基因表達(dá)顯著增高（P＜0.01）。而經(jīng)過8周的間歇有氧運動訓(xùn)練，與NC組大鼠相比，NE組大鼠LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達(dá)顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），ACC基因表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與OC組大鼠相比，OE組大鼠下丘腦LKB1、AMPKα2的基因表達(dá)均顯著增高（P＜0.01），ACC基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01），AMPKα1基因表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠下丘腦LKB1、AMPK、ACC mRNA表達(dá)水平（n=8）

3 討論

AMPK在下丘腦調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡中起著關(guān)鍵作用。AMPK的α1、α2、β1和γ1亞基在下丘腦的弓狀核（ARC）、室旁核（PVN）、腹內(nèi)側(cè)核（VMH）和外側(cè)區(qū)（LHA）中高度表達(dá)[11，12]，AMPK的功能主要由α1和α2亞基決定，AMPKα2亞基對AMP的敏感性要更高并且代表了整個AMPK約80%的活性。下丘腦可以通過AMPK活性的變化調(diào)節(jié)機(jī)體對食物的攝取，研究顯示[12-14]：生理條件下，使用激活劑激活下丘腦AMPK，促進(jìn)了攝食和體重增加，而使用抑制劑抑制下丘腦AMPK的表達(dá)則可以減少食物攝入量和體重。LKB1參與脂肪合成與分解的調(diào)節(jié)[15]，當(dāng)LKB1與STRAD、MO25組成異源三聚體時，可以直接作用于AMPKα亞基中的蘇氨酸172（Thr-172），使其變構(gòu)和磷酸化而被激活，同時可以抑制該位點其它相應(yīng)磷酸酶的去磷酸化作用。乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）分別是脂肪酸合成和氧化分解過程中非常重要的限速酶。ACC可以作用于乙酰輔酶A使其羧化生成丙二酰輔酶A（MCoA），MCoA再在脂肪酸合成酶（FAS）的作用下進(jìn)一步合成脂肪酸。生理條件下，細(xì)胞內(nèi)MCoA濃度的增高能夠抑制CPT-1的活性，從而抑制脂肪酸的氧化分解?；罨腁MPK可以直接作用于ACC，使ACC磷酸化后失去活性，降低細(xì)胞內(nèi)MCoA水平，解除對CPT-1的抑制，脂肪酸氧化分解增強(qiáng)。

3.1 肥胖對大鼠下丘腦LKB 1-AMPK信號傳導(dǎo)通路及能量攝入的影響

肥胖會降低小鼠下丘腦和骨骼肌AMPK的活性[16]。在對肥胖大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)[17，18]，肥胖引起大鼠下丘腦和脂肪組織中LKB1、AMPK活性降低。本研究中，RT-PCR結(jié)果顯示，與NC組大鼠相比，OC組大鼠下丘腦的LKB1、AMPKα1、AMPKα2的基因表達(dá)均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），ACC基因表達(dá)顯著增高（P＜0.01）。這與衣雪潔等[6-8]對肝臟、脂肪、肌肉等外周組織研究結(jié)果基本一致，提示，下丘腦中高脂膳食引起的肥胖同樣抑制了LKB1-AMPK信號通路的傳導(dǎo)，ACC表達(dá)升高，促進(jìn)了脂肪酸合成，抑制了脂肪酸的氧化分解。

本研究還顯示（如圖1、表5所示），與NC組大鼠相比，OC組大鼠下丘腦LKB1、AMPK活性均顯著降低，但大鼠食欲未受抑制且食物和能量攝入均顯著增加，這與很多研究顯示的生理條件下，下丘腦AMPK活性的升高能夠刺激食欲，而AMPK活性的降低會抑制食欲[12-14]并不一致。Marc Claret研究顯示[19]，在小鼠弓狀核POMC神經(jīng)元中特異性敲除AMPKα2亞基會引起小鼠食欲過多而導(dǎo)致肥胖，但在AgRP神經(jīng)元中敲除AMPKα2亞基則會引起年齡依賴性體重降低。在對肥胖小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)[16]，肥胖小鼠進(jìn)食量增加的同時，下丘腦室旁核（PVN）AMPK活性卻顯著降低，弓狀核（ARC）和內(nèi)側(cè)核（MH）的AMPK活性也有降低的趨勢，這與我們對肥胖大鼠的研究結(jié)果基本一致。提示，下丘腦內(nèi)能量平衡調(diào)節(jié)機(jī)制更加精細(xì)，同時，肥胖會改變下丘腦內(nèi)AMPK對食物攝入的調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦弓狀核（ARC）內(nèi)和攝食有關(guān)的神經(jīng)元主要有兩種類型：NPY神經(jīng)元和POMC神經(jīng)元，其可以分泌兩種功能相反的神經(jīng)肽，其中NPY/AGRP主要起著促進(jìn)食欲并減少能量支出的作用，而POMC/CART神經(jīng)肽主要起著抑制食欲并增加能量支出的作用。研究顯示[20]，下丘腦內(nèi)AMPK活性的變化主要作用于NPY神經(jīng)元引起食欲的變化，而下丘腦內(nèi)抑制食欲的POMC神經(jīng)元并不受AMPK活性的影響[17，20]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)[17]，大鼠下丘腦注射AICAR激活劑激活A(yù)MPK后，肥胖組大鼠NPY表達(dá)顯著高于普通對照組，提示肥胖大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元對AMPK更敏感。我們推測，在本研究中，一方面，肥胖引起下丘腦POMC神經(jīng)元抑制，對食欲的抑制作用減弱，大鼠能量攝入增加，而且這種變化不受AMPK活性的影響；另一方面，長時間高脂膳食導(dǎo)致肥胖大鼠對高能量攝入產(chǎn)生的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使得肥胖大鼠在下丘腦AMPK活性較低的情況下NPY高表達(dá)，兩者共同作用致使肥胖大鼠食物和能量攝入的增加。這一推測尚需進(jìn)一步研究。

3.2 間歇有氧運動對大鼠下丘腦LKB 1-AMPK信號傳導(dǎo)通路及能量攝入的影響

衣雪潔等研究顯示[6-8]，運動能夠激活肝臟、脂肪、肌肉等外周組織AMPK活性，并降低了ACC活性。而在下丘腦，Andersson等發(fā)現(xiàn)[21]長時間劇烈運動期間及運動后大鼠下丘腦AMPK活性。ACC磷酸化均未出現(xiàn)顯著變化。Ropelle等研究顯示[22]，2次3 h的游泳運動后大鼠下丘腦AMPK的活性顯著增高。因此，由于運動強(qiáng)度。運動持續(xù)時間以及研究組織的差異，運動對LKB1-AMPK信號通路的影響并不一致，仍需進(jìn)一步研究。本研究中，RT-PCR結(jié)果顯示（如圖1所示），與NC組大鼠相比，NE組大鼠LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達(dá)顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），ACC基因表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與OC組大鼠相比，OE組大鼠下丘腦LKB1基因表達(dá)均顯著增高（P＜0.01），ACC的基因表達(dá)顯著降低（P＜0.01），AMPKα1基因表達(dá)雖然未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05），但代表AMPK80%活性的AMPKα2基因表達(dá)仍顯著增高（P＜0.01）。這提示，8周間歇有氧運動激活了下丘腦LKB1-AMPK信號通路的傳導(dǎo)，ACC表達(dá)降低，促進(jìn)了脂肪酸氧化分解，抑制了脂肪酸的合成，進(jìn)而促使大鼠體重的降低。

本研究還顯示（如圖1、表5所示），分別與NC組、OC組大鼠相比，NE組、OE大鼠下丘腦LKB1、AMPKα2活性顯著提高的同時，大鼠食物和能量攝入均無顯著變化。Ropelle研究發(fā)現(xiàn)[22]，運動促使大鼠下丘腦AMPK活性提高的同時，促進(jìn)了食欲的抑制作用。韓潔研究發(fā)現(xiàn)[23]，分低（L）、中（M）、高（H）三個劑量組對成年SD大鼠下丘腦注射過表達(dá)LKB1腺相關(guān)病毒（AAV）后，3個過表達(dá)組（H、M、L）LKB1和p-AMPKα蛋白表達(dá)均顯著高于對照組；同時與對照組相比，3個過表達(dá)組大鼠脂肪重量均顯著下降，但大鼠進(jìn)食量無顯著差異，這與本研究結(jié)果相似。我們推測，一方面，間歇有氧運動能夠進(jìn)一步激活下丘腦弓狀核（ARC）內(nèi)POMC神經(jīng)元的抑制作用，食欲抑制作用增強(qiáng)；另一方面，間歇有氧運動后大鼠下丘腦內(nèi)AMPK活性增強(qiáng)，刺激NPY神經(jīng)元，食欲增加，兩者的共同作用使得NE組、OE組大鼠食物和能量攝入并未出現(xiàn)顯著變化。這一推測尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究在高脂膳食所引起的老齡肥胖大鼠下丘腦中檢測到LKB1-AMPK信號傳導(dǎo)的失調(diào)以及ACC基因表達(dá)的顯著增加，同時肥胖大鼠能量攝入也顯著增加。而8周的間歇有氧運動通過上調(diào)下丘腦LKB1-AMPK信號傳導(dǎo)通路各因子的基因表達(dá)水平，抑制ACC基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪的氧化分解，同時，大鼠的能量攝入并未增加，兩者的共同作用抑制了高脂膳食所引起的大鼠體重的增加。本研究表明，下丘腦LKB1-AMPK信號傳導(dǎo)通路在間歇有氧運動治療老年肥胖中起重要作用。