20(S)-羥基乙酸喜樹堿酯中間體的制備

郭偉航，陳 松，王先恒,2，周亦琪，趙長闊,2，王玉和

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

喜樹堿(Camptothecin，CPT)為喹啉類生物堿，是一種具有細(xì)胞毒性的天然抗癌藥物分子，其作用機(jī)制在于能抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOPO I)。自1966年Wall等[1]從中國珙桐科植物喜樹分離出喜樹堿，藥物學(xué)家研究開發(fā)喜樹堿類藥物已有53年。喜樹堿本身溶解性差，而其鈉鹽用于臨床研究發(fā)現(xiàn)毒副作用較大，這是因為其六元內(nèi)酯環(huán)在體內(nèi)不穩(wěn)定，導(dǎo)致生物利用度極低，于II期臨床時中斷了研究[2]。一直以來，眾多藥物化學(xué)家都致力于喜樹堿結(jié)構(gòu)改造與修飾，以期通過改善喜樹堿的溶解性能來提升成藥性，或者是延長內(nèi)酯環(huán)在體內(nèi)的保留時間來增加藥物的生理活性、降低毒性[3-9]。

在喜樹堿的20位羥基上引入水溶性基團(tuán)(羧基、氨基等)，不僅可以增加溶解性，也能夠提高內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性。如Wall等[3]用甘氨酸和9-氨基喜樹堿的20位羥基形成酯從而得到相應(yīng)前藥，該前藥在體內(nèi)酶作用下將酯鍵水解得到藥物母體結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗腫瘤藥效，從而有效阻止了內(nèi)酯環(huán)的開環(huán)，大大減低了藥物的毒性，此外也改善了該類化合物的水溶性。

在喜樹堿的20位羥基上也可以引入酯溶性基團(tuán)，如酯基等。1998年，Cao等[2]以喜樹堿和硝基喜樹堿為母體，合成一系列碳數(shù)目在2～7小分子直鏈或支鏈20位-烷基酯。藥理實驗表明，此類烷基酯更好地保護(hù)了內(nèi)酯環(huán)不被開環(huán)破壞，在人體及鼠血漿中該烷基酯能穩(wěn)定存在數(shù)小時，而相應(yīng)沒有修飾的喜樹堿母體藥物短時間內(nèi)即被水解開環(huán)破壞。潘顯道等[4-5]也合成了20位羥基喜樹堿芳氧乙酸和3-(4-取代哌嗪)丙酸等兩類酯的衍生物，這些衍生物在體外對紫杉醇耐藥的前列腺癌、胸腺癌等多種腫瘤細(xì)胞顯示出與喜樹堿及伊立替康相當(dāng)?shù)幕钚?，且小鼠體內(nèi)的耐受劑量也優(yōu)于紫杉醇，預(yù)示了該類衍生物毒性更低，構(gòu)效研究還表明，芳基上稠合六元內(nèi)酯環(huán)及連接亞甲二氧基環(huán)后都增加衍生物的細(xì)胞毒性。

基于以上研究，對喜樹堿20位羥基酯化修飾并合成一系列的新型喜樹堿衍生物成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，這些衍生物的合成如圖1所示。

圖1 20(S)-喜樹堿酯的合成

在文獻(xiàn)研究中，對于20-位喜樹堿衍生物的關(guān)鍵中間體羥基乙酸喜樹堿的合成中，一方面收率不高，副產(chǎn)物很多，同時起始原料也被完全消耗掉，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高[10]，因此本文擬對該關(guān)鍵中間體羥基乙酸喜樹堿的合成方法進(jìn)行工藝改進(jìn)，通過對反應(yīng)試劑、溶劑和催化劑等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選，找到適合工業(yè)化生產(chǎn)的合成工藝。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 喜樹堿(98%，上海源葉生物科技有限公司)、芐氧乙酸(分析純，Aladdin)、鈀碳(10%)、N,N'-二異丙基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶(分析純，ACROS)；二氯甲烷、甲醇(分析純，重慶川東化工)；柱層析用硅膠(粒度200～300目，青島海洋化工廠)、硅膠薄層板(青島海洋化工廠)。

儀器采用81-2型暗箱三用紫外分析儀(上海司樂儀器有限公司)；Varian 400MHz核磁共振波譜儀(TMS作內(nèi)標(biāo)，安捷倫科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 芐氧乙酸20-(S)喜樹堿酯的合成 將喜樹堿1(1 g，3.45 mmol)和二氯甲烷(35 mL)投入圓底燒瓶中，在常溫下攪拌，得黃色懸浮液。依次加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，500 mg，4.1 mmol)，芐氧乙酸(1 mL，6.02 mmol)和N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIPC，5 mL，39.68 mmol)，在常溫下繼續(xù)攪拌2 min，溶液由黃色懸浮液變?yōu)辄S色澄清液，繼續(xù)攪拌5 min又變?yōu)辄S色懸浮液，攪拌12 h，TLC點(diǎn)板追蹤，展開劑(二氯甲烷∶甲醇= 97∶3/體積比)在紫外燈254 nm下觀察。反應(yīng)停止，過濾，干燥，得化合物2(1.08 g，產(chǎn)率100%)，形狀：黃色固體，合成路線見圖2。1HNMR (400 MHz,CDCl3) (=8.67 (s,1 H),8.11 (dd,J=16.2 Hz,8.1 Hz,2H),7.85 (t,J= 7.8 Hz,1H),7.71 (t,J= 8.0 Hz,1H),7.10-7.26 (m,5H),7.07 (s,1H),5.49 (s,1H),5.28 (s,1H),4.61(s,2H),4.34 (d,J=16.0 Hz,1H),4.18 (d,J=16.0 Hz,1H),3.34 (q,J=8.2 Hz,2H),2.1-2.3(m,2H),1.0(t,J=7.9 Hz,3H)。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6) (=169.52,167.19,157.26,152.22,148.81,146.36,145.39,136.81,131.15,130.63,129.54,128.43,128.10,127.97,120.27,95.80,76.38,73.27,67.16,66.59,49.90,31.74,7.52。

圖2 芐氧乙酸20-(S)喜樹堿酯的合成

1.2.2 羥基乙酸20-(S)喜樹堿酯第二步反應(yīng) 取化合物2(200 mg,0.4 mmol)投入Schlenk瓶中，加入二氯甲烷10 mL，再加入10% Pd/C(50 mg,0.5 mmol)抽去Schlenk瓶中的空氣，通入H2在30 ℃的恒溫攪拌器中攪拌24 h，TLC點(diǎn)板追蹤，展開劑(二氯甲烷∶甲醇= 97∶3)在紫外燈254 nm下觀察。反應(yīng)停止，過濾除去催化劑，將濾液旋干，柱層析，洗脫劑(二氯甲烷∶甲醇= 60∶1.5)，收集，旋干，油泵抽10 min，得黃色固體產(chǎn)物3(58.2mg，產(chǎn)率36%)，具體反應(yīng)步驟見圖3。M.p.159-160°C,Rf= 0.3(DCM:CH3OH=97:3)。1HNMR (400MHz,DMSO-d6) (=8.69 (s,1H),8.14 (dd,J= 8.0 Hz,8.0 Hz,2H),7.85 (t,J= 7.8 Hz,1H),7.70 (t,J= 8.2 Hz,1H),7.08 (s,1H),5.49 (s,1H),5.29 (s,1H),4.33 (d,J=16.0 Hz,1H),4.16 (d,J=16.0 Hz,1H),3.42 (q,J=7.8 Hz,2H),2.07-2.17 (m,2H),0.95 (dt,J=8.2 Hz,8.2 Hz,3H)。13C NMR (100 MHz,DMSO-d6) (=172.17,167.69,157.19,156.98,152.77,148.29,146.41,145.81,132.06,130.89,130.27,129.33,128.99,128.77,128.76,128.43,128.25,128.24,128.21,128.17,119.26,95.43,76.29,66.65,59.78,50.70,30.56,23.73,7.99。

圖3 羥基乙酸20-(S)喜樹堿酯第二步反應(yīng)

2 結(jié)果

2.1 羥基乙酸20-(S)喜樹堿酯中間體的合成及產(chǎn)率 按照文獻(xiàn)步驟，首先以喜樹堿為原料，在DIPC/DMAP條件下，與芐氧乙酸在二氯甲烷中反應(yīng)，以定量收率得到芐氧乙酸20-(S)喜樹堿酯。產(chǎn)物不需要進(jìn)一步分離，可直接應(yīng)用于下一步反應(yīng)。

對于下面緊接的脫芐基反應(yīng)，我們通過優(yōu)化催化劑的種類，反應(yīng)溶劑的選擇，最終發(fā)現(xiàn)以10%Pd/C為催化劑，二氯甲烷為溶劑，進(jìn)行催化加氫，順利得到目標(biāo)中間體產(chǎn)率36%，同時對未反應(yīng)的原料進(jìn)行回收，回收率可達(dá)62%。

2.2 結(jié)構(gòu)表征 根據(jù)化合物1.2.1的H-NMR 譜圖可知：① 通過EDCI偶聯(lián)反應(yīng)，芐氧乙酸成功引入20-羥基。該化合物在化學(xué)位移 (=7.10-7.26的位置有5個氫，表明一個苯環(huán)的引入。同時在(=4.61 的位置有2H，峰型為單峰，表明鏈接為OCH2-基團(tuán)。② 對于最后的目標(biāo)化合物， 我們發(fā)現(xiàn)，(=7.10-7.26的位置的苯環(huán)峰以及 (=4.61位置的單峰都消失了。顯示出通過鈀碳加氫反應(yīng)，芐基被很容易的脫掉了。

2.3 還原反應(yīng)的工藝優(yōu)化 我們通過對還原條件中Pd/C，反應(yīng)溶劑等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，最終發(fā)現(xiàn)了較好的工藝生產(chǎn)條件(見表1)。

表1 還原反應(yīng)的工藝優(yōu)化

3 討論

由于文獻(xiàn)中采用10%Pd/C和環(huán)己烯的還原條件，得到目標(biāo)中間體收率36%，但是副產(chǎn)物很多，同時原料也被完全消耗掉，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。因此對于開發(fā)此中間體的工業(yè)生產(chǎn)，必須進(jìn)行工藝優(yōu)化。

實驗過程中運(yùn)用10%Pd/C和環(huán)己烯的反應(yīng)條件，產(chǎn)率僅為36%，產(chǎn)率不高且副反應(yīng)多。進(jìn)一步采用10%Pd/C/甲酸銨和10%Pd/C/加氫，這兩種反應(yīng)條件下產(chǎn)物產(chǎn)率依次為15%和31%～35%，結(jié)果仍然不夠理想。雖然和10%Pd/C/環(huán)己烯產(chǎn)率一樣高，但用氫氣催化副產(chǎn)物少，且容易分離，原料可以回收，可以重復(fù)利用。在10% Pd/C/H2條件下，用二氯甲烷做溶劑產(chǎn)物生成時間比用甲醇做溶劑短。所以綜上，最后采用10%Pd/C/ H2/二氯甲烷的條件進(jìn)行中間體的制備。

本文從催化劑的種類和反應(yīng)的溶劑兩個方面進(jìn)行優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)10%Pd/C/ H2/二氯甲烷的條件用于中間體制備的第二步反應(yīng)時，相對于其他條件時間快，副產(chǎn)物少。