TFB1M在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

楊世榮 陳艷琴 白翔宇 甘露 何顯力

結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)分別位居第三和第二位［1］。大多結(jié)直腸癌患者確診時已處于中晚期，患者預(yù)后差異較大。但目前結(jié)直腸癌發(fā)病及進(jìn)展的機(jī)制尚不完全清楚，可用于預(yù)測患者預(yù)后的標(biāo)志物亦有限。線粒體是一種能量供應(yīng)的重要細(xì)胞器，參與ATP合成，可調(diào)控細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和生物合成代謝等［2］。大量研究證實，線粒體功能異常幾乎在所有腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［3-6］。線粒體轉(zhuǎn)錄因子 B1（mitochondria transcription factor B1，TFB1M）是線粒體轉(zhuǎn)錄起始因子，在調(diào)控線粒體氧化磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，已被證實在多種實體腫瘤中表達(dá)異常［7-8］，但在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確。本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織中TFB1M的表達(dá)并利用癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫的結(jié)直腸癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床樣本信息，分析TFB1M表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，同時在結(jié)直腸癌細(xì)胞中調(diào)控TFB1M的表達(dá)后觀察其對細(xì)胞增殖的影響，探討TFB1M與結(jié)直腸癌的關(guān)系，為結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測及治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620和HCT116購自ATCC細(xì)胞庫。胎牛血清購自中國BBI Life Sciences公司，青鏈霉素混合液購自中國索萊寶公司，DMEM培養(yǎng)基購自中國瑞博公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司，蛋白Marker購自美國Thermo Fisher公司，MTS檢測試劑盒購自美國 Promega公司，β-actin抗體和兔二抗購自中國北京天德悅公司，TFB1M抗體購自美國OriGene公司，攜帶TFB1M干涉、過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒購自中國上海吉瑪基因公司。

1.2 組織樣本來源

收集2015年1月至2019年1月于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院手術(shù)治療的112例結(jié)直腸癌患者的臨床資料。所有患者術(shù)前均未經(jīng)任何抗腫瘤治療，其癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診，并由2位病理學(xué)醫(yī)師診斷及復(fù)核。所有組織樣本取下后立即液氮冷凍，-80℃冰箱保存。本研究獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。中位隨訪時間為28個月，總生存期定義為手術(shù)日至患者死亡或末次隨訪的時間。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測TFB1M的表達(dá)

組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟后用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原高壓修復(fù)，山羊血清室溫封閉，滴加稀釋的TFB1M抗體（1∶800），4℃孵育過夜，兔二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS代替一抗為陰性對照。細(xì)胞染色強度評分：無染色計0分，黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。細(xì)胞陽性率評分：0～9%計0分，10%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分。陽性綜合評分為染色強度評分與陽性細(xì)胞率評分的乘積：≤3分為低表達(dá)，＞3分為高表達(dá)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)分析

利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA（http：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/） 數(shù)據(jù)庫下載 575 例結(jié)直腸癌患者的mRNA表達(dá)二代測序數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。以基因表達(dá)中位值（5.8）分組，＞5.8為TFB1M高表達(dá)組，≤5.8為TFB1M低表達(dá)組。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染

人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和HCT116用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔板，實驗分為4組：shCtrl組轉(zhuǎn)染陰性干涉質(zhì)粒慢病毒，shTFB1M組轉(zhuǎn)染TFB1M干涉質(zhì)粒慢病毒，EV組轉(zhuǎn)染含空載質(zhì)粒慢病毒，TFB1M組轉(zhuǎn)染含TFB1M過表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染：960 μL無血清DMEM培養(yǎng)基+40 μL感染增強液+5 μL病毒原液（病毒濃度為1×108/mL），10 h后更換含血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，采用嘌呤霉素（濃度為5 ng/mL）進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染抗性篩選。

1.6 Western blot檢測TFB1M的表達(dá)

RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度并添加5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴10 min后上樣，10%聚丙烯酰胺分離凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉，添加一抗TFB1M（稀釋比例為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；二抗β-actin（稀釋比較為1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌液清洗，然后采用熒光成像進(jìn)行定量檢測，Image J軟件分析條帶，以β-actin蛋白條帶灰度值為參照。

1.7 MTS法檢測細(xì)胞增殖能力

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW620和HCT116細(xì)胞，以2×103/孔細(xì)胞密度接種至96孔板，設(shè)5個復(fù)孔及陰性對照，待細(xì)胞貼壁后加入20 μL/孔MTS工作液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。利用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度值，記錄為起始數(shù)據(jù)（0 h），同樣方法分別于 24 h，48 h，72 h，96 h再次檢測，根據(jù)記錄數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；采用Kaplan-Meier法計算生存率，兩組生存曲線比較采用Log-rank檢驗，Cox等比例風(fēng)險回歸模型分析TFB1M表達(dá)水平與總生存期的關(guān)系，計算風(fēng)險比（HR）及其對應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。shCtrl組和shTFB1M組細(xì)胞增殖能力的差異，采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFB1M在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，TFB1M主要染色于細(xì)胞質(zhì)，癌旁正常結(jié)腸上皮細(xì)胞大部分呈中至強染色，結(jié)直腸癌細(xì)胞呈部分弱染色。結(jié)直腸癌組織及其癌旁正常組織中TFB1M的陽性表達(dá)評分分別為（3.79±1.66）分和（8.14±1.82）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 1。

圖1 TFB1M在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（SP×200）Fig.1 Expression of TFB1M in colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×200）

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

TCGA公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示，TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中的表達(dá)較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低（P=0.010），而不同年齡、性別患者TFB1M表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。Kaplan-Meier生存分析顯示，TFB1M高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的中位生存時間分別為99個月和79個月，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.038），見圖2。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer of TCGA

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer of TCGA

2.3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的單因素和多因素分析

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的單因素Cox模型分析結(jié)果顯示，TFB1M mRNA表達(dá)水平、年齡、TNM分期與結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期有關(guān)（P＜0.05），多因素Cox模型分析顯示，年齡、TNM分期和TFB1M mRNA表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的獨立因素（P＜0.05），見表 2。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer of TCGA

2.4 基于臨床樣本分析TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

不同年齡、性別的結(jié)直腸癌患者TFB1M表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達(dá)較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005），見表 3。Kaplan-Meier生存分析顯示，TFB1M高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的中位生存時間分別為33個月和23個月，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008），見圖 3。

2.5 基于臨床樣本的單因素和多因素分析

單因素Cox模型分析發(fā)現(xiàn)，TFB1M蛋白表達(dá)水平（P=0.002）、年齡（P=0.005）和 TMN 分期（P＜0.001）與結(jié)直腸癌患者總生存期有關(guān)。多因素Cox模型分析顯示TFB1M表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者總生存期的獨立因素（P=0.029）。見表4。

2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和HCT116后TFB1M的表達(dá)水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中，shTFB1M組TFB1M表達(dá)均較shCtrl組顯著降低（0.32±0.03 vs 0.93±0.12，P＜0.001；0.17±0.05 vs 0.56±0.11，P＜0.001），而 TFB1M 組 TFB1M 的表達(dá)均顯著高于 EV 組（1.49±0.19 vs 0.94±0.08，P＜0.001；1.63±0.08 vs 0.62±0.06，P＜0.001），見圖4。說明TFB1M干涉和過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和HCT116構(gòu)建成功。

2.7 干涉/過表達(dá)TFB1M對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

MTS實驗檢測結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞和HCT116細(xì)胞中，shTFB1M組的細(xì)胞增殖能力均較shCtrl組顯著增強（F=80.6，P＜0.001；F=532.6，P＜0.001），而 TFB1M組細(xì)胞增殖能力均較EV組下降（F=130.2，P＜0.001；F=55.0，P=0.002），見圖 5。

圖3 TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 The relationship between expression of TFB1M and prognosis of patients with colorectal cancer

表3 TFB1M表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系Tab.3 The relationship between the expression of TFB1M and clinical features of patients with colorectal cancer

表4 影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存期的單因素和多因素分析Tab.4 Univariate analysis and multivariate analysis of postoperative overall survival in patients with colorectal cancer

圖4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后SW620和HCT116細(xì)胞中TFB1M蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of TFB1M in SW620 and HCT116 cells after lentivirus transfection were detected by Western blot

圖5 MTS法檢測干涉/過表達(dá)TFB1M后結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和HCT116的增殖能力Fig.5 The proliferation of SW620 and HCT116 cells after interference/overexpression of TFB1M detected by MTS

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜過程［9］。結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中，細(xì)胞能量代謝變化和活性氧等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮著重要調(diào)控作用［10］。線粒體是細(xì)胞重要的能量代謝樞紐，也是活性氧和活性氮的重要來源，在腫瘤進(jìn)展各個階段可通過代謝重編程、分裂融合、氧化還原穩(wěn)態(tài)、氧化應(yīng)激信號傳導(dǎo)等方式影響腫瘤細(xì)胞生長和生存。線粒體DNA（mtDNA）具有獨立的環(huán)狀雙鏈DNA，由線粒體RNA聚合酶（mtRNAP）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A（TFAM）、TFB1M、線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2（TFB2M）組成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可參與mtDNA上各種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而影響線粒體功能發(fā)揮［8］。TFB1M作為轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的重要組成部分，其表達(dá)異?？芍苯佑绊懠?xì)胞線粒體的功能發(fā)揮［11］。研究發(fā)現(xiàn)與TFB1M功能相似的其他線粒體轉(zhuǎn)錄因子，如TFAM 在腎細(xì)胞癌［12］和肺癌［13］等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。在結(jié)直腸癌中，TFAM的雜合性缺失可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞線粒體功能異常、活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄積，進(jìn)而促進(jìn)小鼠腸道自發(fā)成瘤［14］。同樣在微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)直腸癌中，TFAM框移突變也可通過降低mtDNA拷貝數(shù)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑等化療藥物抵抗［15］。以上研究提示線粒體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

本研究收集結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除樣本及臨床資料，免疫組織化學(xué)法檢測證實TFB1M在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，結(jié)合TCGA公共數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床樣本信息分析TFB1M與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)中TFB1M在Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達(dá)均較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低，且TFB1M低表達(dá)患者術(shù)后總生存期顯著低于高表達(dá)患者，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)TFB1M是影響患者總生存的獨立因素，說明TFB1M可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生，且TFB1M低表達(dá)患者預(yù)后不良。本研究進(jìn)一步在細(xì)胞水平研究TFB1M與結(jié)直腸癌的關(guān)系，通過慢病毒轉(zhuǎn)染法分別在結(jié)直腸癌SW620和HCT116細(xì)胞中干涉和過表達(dá)TFB1M，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干涉TFB1M可顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌SW620和HCT116細(xì)胞的增殖能力，而過表達(dá)TFB1M則抑制其增殖能力，初步證實TFB1M表達(dá)異?？赡芡ㄟ^影響線粒體功能而對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖發(fā)揮調(diào)控作用。既往有研究報道TFB1M缺失可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能異常，進(jìn)而引起活性氧蓄積［16］。而ROS與腫瘤發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，可引起細(xì)胞中包括DNA在內(nèi)的大分子損傷，是體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的重要危險因素［17-18］。TFB1M在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低是否通過引起ROS蓄積，進(jìn)而促進(jìn)抑癌基因突變和促癌基因活化導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強仍有待進(jìn)一步探討。

本研究通過公共數(shù)據(jù)分析和臨床樣本驗證，以及體外細(xì)胞實驗證實TFB1M在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，且低表達(dá)者預(yù)后較差，干涉TFB1M可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，TFB1M可能是結(jié)直腸癌潛在的預(yù)后評估標(biāo)志物和治療靶點。但本研究納入臨床樣本量有限，TFB1M在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常及其與患者預(yù)后的相關(guān)性，以及在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍需擴(kuò)大臨床樣本量及動物模型進(jìn)一步研究。