糖尿病足患者外周血S100 A12的表達(dá)及價(jià)值

李開(kāi)宇

（濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272000）

糖尿病的發(fā)病率隨著我國(guó)人口老齡化的出現(xiàn)而表現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)[1]，同時(shí)，也致使糖尿病足的臨床發(fā)病率出現(xiàn)顯著提升，目前臨床上針對(duì)糖尿病足的治療主要依靠藥物治療和血管腔內(nèi)治療，然而，一旦上述治療措施無(wú)效，需要對(duì)患者實(shí)施截肢手術(shù)進(jìn)行治療，這就會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活，并造成極大地痛苦[2-3]。鑒于糖尿病足發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未被完全認(rèn)知，因此，充分探討影響糖尿病足的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于該病的治療具有至關(guān)重要的指導(dǎo)價(jià)值[4]。據(jù)申昕等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足的誘發(fā)與人體的炎性反應(yīng)密切相關(guān)，而S100A12與糖尿病足的誘發(fā)有著密切的聯(lián)系。該文以

2017年8月—2019年8月為研究段，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)糖尿病足患者血清中的S100A12表達(dá)情況，以期給糖尿病足患者的診療提供以依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將在該院進(jìn)行治療的60例糖尿病足患者納為研究組，而將同期治療的60例非糖尿病足的糖尿病患者納為糖尿病組，此外，將同期進(jìn)行健康體檢的60名成年人納為對(duì)照組，通過(guò)Wagner分級(jí)法將60例糖尿病足患者進(jìn)行分級(jí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入選對(duì)象均對(duì)該研究享有知情權(quán)且能夠積極配合檢測(cè)；（2）入選對(duì)象均未見(jiàn)嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙及惡性腫瘤；（3）該研究所采用的試驗(yàn)方案獲得該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。其中，研究組患者：男性32例，女性28例；年齡范圍45～79歲，平均年齡(66.23±3.67)歲；糖尿病組：男性34例，女性26例；年齡范圍47～77歲，平均年齡(68.34±4.09)歲；對(duì)照組患者：男性31名，女性29名；年齡范圍48～81歲，平均年齡(69.58±4.38)歲；3組受檢對(duì)象中的性別、年齡相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 收集血液標(biāo)本

讓入選對(duì)象保持空腹，于清晨抽取其10 mL肘靜脈血，將其置于肝素抗凝管中，之后進(jìn)行10 min離心操作（轉(zhuǎn)速：3 000 r/min），將血漿分離出來(lái)后，放置在-80℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3 檢測(cè)外周血中的S100 A12蛋白

通過(guò)westernblot法對(duì)3組入選對(duì)象血清中的S100 A12蛋白表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定，對(duì)血漿蛋白進(jìn)行定量后，在凝膠泳道加入35μg/孔的蛋白，在80 V下，電泳0.5 h，之后再在100 V下電泳1h；轉(zhuǎn)膜后，再采用5%的脫脂牛奶封閉1 h，最后在甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和5%牛奶稀釋后的S100A12抗體(比例1∶200)中進(jìn)行孵育過(guò)夜（維持4℃），孵育完成后以TBST和5%的牛奶稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗進(jìn)行洗膜，洗膜后，嚴(yán)格按照ECL說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光工作液，通過(guò)凝膠成像儀成像，最后通過(guò)ImageJ軟件處理和分析。

1.4 檢測(cè)外周血中IL-6和TNF-α的表達(dá)量

通過(guò)ELISA試劑盒測(cè)定IL-6和TNF-α的表達(dá)量，操作步驟遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)：測(cè)量前，將樣本和試劑盒平衡至室溫，使用標(biāo)本稀釋液以1∶1的比例稀釋待檢標(biāo)本，將50μL稀釋后的標(biāo)本加入至反應(yīng)孔內(nèi)，同時(shí)，將稀釋好的50μL標(biāo)準(zhǔn)品、50μL待測(cè)樣品也放至反應(yīng)孔，然后立即加入50μL生物素標(biāo)記的抗體。將膜板蓋上，并輕輕振蕩混勻，在37℃下溫育1 h。將孔內(nèi)液體甩去后加滿洗滌液，振蕩1 min，再次甩去洗滌液，用吸水紙拍干（上述操作重復(fù)3次）。每孔各加入50μL底物A、B，將其輕輕振蕩混勻，在37℃的避光條件下溫育10 min。取出酶標(biāo)板，快速加入50μL終止液，并立即測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)下，對(duì)各孔的OD值進(jìn)行測(cè)定。分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血漿樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得其對(duì)應(yīng)的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

該次分析數(shù)據(jù)的為SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。通過(guò)Pearson分析方法分析其相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100 A12、IL-6和INF-α蛋白的表達(dá)情況

與健康對(duì)照組相比，研究組和糖尿病組血清中的S100 A12、IL-6和TNF-α的表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但研究組的上升趨勢(shì)更加明顯，研究組和糖尿病組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 S100 A12、IL-6和INF-α蛋白的表達(dá)情況（±s）

表1 S100 A12、IL-6和INF-α蛋白的表達(dá)情況（±s）

注：與正常對(duì)照組比較a P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與非糖尿病足比較b P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別S100 A12(S100 A12/GAPDH)IL-6(ng/mL)TNF-α(ng/mL)對(duì)照組（n=60）糖尿病組（n=60）研究組（n=60）0.09±0.02（0.13±0.07）a（0.78±0.15）ab 10.4±1.6（19.1±3.3）a（32.8±5.4）ab 8.2±2.7（14.6±3.5）a（98.6±7.6）ab

2.2 S100 A12、IL-6和TNF-α在糖尿病足患者的不同分級(jí)中的表達(dá)情況

通過(guò)分析S100 A12、IL-6和TNF-α在糖尿病足患者的不同分級(jí)中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，糖尿病足患者的嚴(yán)重程度與其外周血中的S100 A12、IL-6和TNF-α的表達(dá)量緊密相關(guān)，患者的病情越重，相應(yīng)的，其外周血中的S100 A12、IL-6和TNF-α的表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 S 1 00 A12、IL-6和TNF-α在糖尿病足患者不同分級(jí)中的表達(dá)情況（±s）

表2 S 1 00 A12、IL-6和TNF-α在糖尿病足患者不同分級(jí)中的表達(dá)情況（±s）

注：與1級(jí)比較，a P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Wagner分級(jí)S100 A12(S100 A12/GAPDH)IL-6(ng/mL)TNF-α(ng/mL)1（n=18）2（n=12）3（n=10）4（n=12）5（n=8）0.35±0.06 0.58±0.09（0.77±0.12）a（0.81±0.13）a（0.87±0.16）a 18.8±2.2 23.7±6.6（31.3±7.0）a（33.2±6.5）a（35.6±7.3）a 70.2±7.1 91.4±7.4（98.3±8.2）a（100.1±10.6）a（108.3±12.1）a

2.3 S100 A12與TNF-α和IL-6表達(dá)的關(guān)系

通過(guò)Pearson分析方法分析糖尿病足患者血清中S10 0A12的表達(dá)量與TNF-α和IL-6的表達(dá)量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r2=0.58，r2=0.69，P＜0.05)。

3 討論

S100 A12屬于鈣結(jié)合蛋白家族，其主要是由中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞合成和分泌而來(lái)，共包含90多個(gè)氨基酸，而且還含有4個(gè)螺旋亞基的反向平行結(jié)構(gòu)，在一些炎癥反應(yīng)和腫瘤等多種病理性疾病的誘發(fā)過(guò)程中扮演重要角色[6-7]。S100 A12和鈣離子結(jié)合后，其C端會(huì)暴露出1個(gè)疏水性裂隙，此裂隙是其靶蛋白的識(shí)別位點(diǎn)，因此，S100 A12能夠和特異性的蛋白或肽類(lèi)識(shí)別并結(jié)合[8]。當(dāng)患者缺乏鈣離子時(shí)，S100 A12蛋白主要存在于細(xì)胞漿中；當(dāng)富余鈣離子時(shí)，則S100 A12蛋白會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞支架和細(xì)胞膜上。高級(jí)聚糖化終產(chǎn)物以S100 A12蛋白的配體為受體，S100 A12在和RAGE結(jié)合后，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活（如NF-κB和絲裂原激活蛋白激酶），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎性因子如TNF-α和IL-6的合成和分泌過(guò)程的調(diào)控，既往研究中，TNF-α和IL-6已經(jīng)被證實(shí)是糖尿病足的發(fā)病機(jī)制中重要一環(huán)，因此該研究推測(cè)，S100 A12蛋白的異常是糖尿病足誘發(fā)的根本原因。

該研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，研究組和糖尿病組血清中的S100 A12、IL-6和TNF-α的表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但研究組的上升趨勢(shì)更加明顯，研究組和糖尿病組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，糖尿病足患者的病情越重，相應(yīng)的，其外周血中的S100 A12、IL-6和TNF-α的表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；此外，通過(guò)Pearson分析方法分析糖尿病足患者血清中S100 A12的表達(dá)量與TNF-α和IL-6的表達(dá)量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r2=0.58，r2=0.69，P＜0.05)。

綜上所述，外周血中S100 A12的表達(dá)量在糖尿病足患者中會(huì)出現(xiàn)顯著上升的情況，其可能在糖尿病足發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。