ADCY9基因介導吉西他濱肺腺癌耐藥的系統(tǒng)生物學研究

王桂平，梁杰聰，張彥燾 ，李智斌

(1.廣州衛(wèi)生職業(yè)技術學院藥學系，廣東 廣州 510180；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心外科，廣東 廣州 510623)

肺腺癌是常見的肺癌類型，約占原發(fā)性肺癌的40%，嚴重危害人類健康。手術切除仍是最有效的早期肺腺癌治療手段，但不幸的是，大多數肺癌發(fā)現時均進入晚期，已喪失手術最佳治療時間。近年來，靶向藥物如吉非替尼、克唑替尼等明顯改善肺癌的生存率，然后，由于大多數已為晚期腫瘤患者，以及某些患者體內存在不同的基因突變及遺傳異質性致使化療耐藥產生，目前數據顯示化療的有效率僅為20%～40%，肺癌總體生存率仍然非常低[1]。

吉西他濱(Gemcitabine)是一種新型胞嘧啶核苷衍生物，也是目前晚期(Ⅳ期)肺腺癌等非小細胞肺癌的一線用藥。隨著吉西他濱在臨床的廣泛應用，腫瘤耐藥性也成為制約吉西他濱臨床療效的關鍵問題[2]。目前，已發(fā)現ENT1、RRM1及CDA等基因可能是導致吉西他濱耐藥性產生的重要因子，但這些因子是否可以作為個體化治療生物標志物，仍需進一步研究。腫瘤化療耐藥性產生機制相當復雜，涉及較多基因及生物信號轉導過程。本研究中，我們將基于TCGA、GEO數據平臺，采用系統(tǒng)生物學模式，構建吉西他濱肺腺癌耐藥蛋白調控網絡，從調控網絡中挖掘可能的耐藥因子，尋找具有臨床應用前景的個體化治療標志物。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜數據集獲取及差異基因表達分析 從NCBI的GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中獲得基因表達譜數據集(No:GSE6914)。該數據集采用GPL96芯片平臺([HG-U133A]Affymetrix Human Genome U133A Array)，包括20個配對樣本，本研究選擇其中的8個樣本進行研究，即4個Calu3正常細胞樣本和4個gemcitabine耐藥Calu3細胞樣本。采用dChip分析軟件進行差異基因分析，獲得gemcitabine耐藥的差異表達基因(DEGs),具體操作方法按dChip操作指南進行(http:// www.dchip.org )，2-fold change的基因被選擇為差異表達基因。

1.2 差異表達基因的go和pathway聚類分析[3]采用DAVID在線分析軟件(https://david.ncifcrf.gov/)對差異基因進行基因注釋、生物信號通路功能聚類分析，選擇P<0.05,且富聚數量基因≥10的聚類結果。

1.3 蛋白質相互作用網絡構建及hub基因發(fā)現[4]采用STRING軟件(https://string-db.org/)構建gemcitabine耐藥蛋白質相互作用網絡，然后，應用cytohubb APP 分析蛋白質相互作用網絡，獲得排列前10位的10個hub基因。

1.4 hub基因的在腫瘤組織中表達分析[5]Oncomine數據庫已經收集了729個基因表達數據集，90 000多個癌癥組織和正常組織的樣本數據，是目前世界上最大的癌基因芯片數據庫和整合數據挖掘平臺，可用于比較主要癌癥類型和各自正常組織的差異表達分析，也可以用于探索各種癌癥亞型以及基于臨床和病理學的分析。本項目應用Oncomine 數據庫，比較hub基因在肺腺癌等腫瘤與相應正常組織中的表達水平。

1.5 ADCY9基因表達及預后分析 基于Oncomine 數據庫，系統(tǒng)分析ADCY9在肺腺癌與癌旁正常組織中的表達差異；采用GEPIA分析工具(http://gepia.cancer-pku.cn)，分析ADCY9 mRNA表達水平與肺腺癌總體生存率的關系。

1.6 ADCY9共表達基因分析 基于GSE6914數據集中gemcitabine耐藥和敏感的樣本，通過Oncomine數據庫分析ADCY9的共表達基因，并采用DAVID分析工具對共表達基因進行基因與信號通路的聚類分析。

2 結果

2.1 吉西他濱誘導肺腺癌耐藥的差異表達基因 本研究采用dChip分析軟件對GSE6914數據集中8個樣本進行差異基因分析，最終獲得差異表達基因391個，其中上調基因80個，下調基因311個(數據未提供)。信號通路富集分析顯示，RAP1、RAS及PI3K-AKT等通路顯著下調(見圖1)；而基因生物學功能富集顯示，正向調控細胞轉移、細胞增殖等過程基因表達顯著上調，而炎癥反應相關免疫因子、正向調控鈣離子活動及細胞外間隙等生物過程中的基因則顯著下調表達(見圖2)。

圖1 吉西他濱肺腺癌耐藥差異表達基因KEGG通路富集分析

圖2 吉西他濱肺腺癌耐藥差異表達基因GO富集分析

2.2 吉西他濱誘導肺腺癌耐藥的hub基因篩選 吉西他濱誘導的肺腺癌耐藥差異表達基因，經基因生物功能及信號通路富集后，將顯著富集基因輸入STRING軟件進行蛋白質相互作用網絡構建，獲得162個結點，126條邊,平均節(jié)點度為1.56，PPI網絡富集具有顯著性(P=0.019 5)。應用cytohubba APP對網絡進行分析，獲得排列前10的hub基因，即BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9、SSTR3、CXCR1、CCL13、PTGER3、 HRH3 及INSL5(如圖3)。

圖3 吉西他濱耐藥肺腺癌蛋白質相互作用網絡及hub基因

2.3 hub基因在肺腺癌及其他腫瘤組織中的表達分析 基于TCGA和Oncomine庫分析，結果顯示10個hub基因在肺癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、白血病等人類腫瘤中主要以下調表達為主，其中，ADCY9、CCL13及OTGER3基因在肺腺癌存在明顯表達下調，而其他hub基因則出現較大的腫瘤異質性，其表達情況不明確(見圖4)。

2.4 ADCY9基因在肺腺癌中表達及預后分析 在所有hub基因中，ADCY9的表達與肺腺癌關系最為顯著，該基因在肺腺癌中明顯表達下調，生存分析也發(fā)現ADCY9基因高水平表達可降低肺腺癌總體死亡風險(log rankP=0.014)，如圖5所示。

2.5 ADCY9基因介導吉西他濱肺腺癌耐藥機制 ADCY9基因可能是影響肺腺癌發(fā)生進展的重要因子，該基因的異常表達是否與吉西他濱肺腺癌耐藥有關。ADCY9基因在吉西他濱肺腺癌耐藥中的表達情況分析結果顯示(見圖6)：ADCY9基因在吉西他濱耐藥的肺腺癌樣本中表達下調，而對吉西他濱敏感的肺腺癌樣本中則上調表達?；蚬脖磉_分析發(fā)現，ADCY9基因與SMAD6存在相似的表達，相關性分析也顯示ADCY9與SMAD6基因具有顯著相關性(P=5.6×10-27,R=0.44，見圖7)。對獲得的ADCY9共表達基因進行基因功能與信號通路聚類分析發(fā)現，共表達基因主要涉及肌醇磷酸化、MAPKK活化、鈣離子負性轉運、蛋白磷酸化負性調控、細胞生長負性調控等生物學過程，以及Rho蛋白及G蛋白信號等信號通路(見圖8)。

圖4 hub基因在人類常見腫瘤中的表達分析

1.吉西他濱耐藥組；2.吉西他濱敏感組

圖7 ADCY9與SMAD6基因相關性分析結果

圖8 ADCY9共表達基因KEGG 通路及基因GO富集結果

3 討論

吉西他濱是一種新型人工合成嘧啶核苷類似物，主要通過抑制DNA，干擾癌細胞的復制產生抗腫瘤效應，是晚期非小細胞肺癌等腫瘤治療的重要藥物。然而，較多的患者仍然對其產生了耐藥性，最終導致治療失敗，因此，探索吉西他濱耐藥的分子機制，一直以來是科學家研究的重點。本研究獲得吉西他濱耐藥的肺腺癌差異表達基因譜，該表達譜主要以下調基因表達(311個下調基因)為主，主要表現為RAP1、RAS及PI3K-AKT、鈣離子活動正向調控等通路顯著下調表達。接著，基于生物過程及信號通路富集結果，我們構建了吉西他濱耐藥的蛋白質相互作用網絡，并獲得BDKRB2、BDKRB1、POMC、ADCY9等10個hub基因，其中ADCY9基因在肺腺癌組織中明顯下調表達，并且與肺腺癌的預后有關。

ADCY9基因主要催化信號分子cAMP的形成，其作用主要受 GPCRs、鈣等調控。ADCY9基因在肺腺癌組織中明顯低表達，該基因是否也與吉西他濱所致肺腺癌耐藥有關？本研究進一步分析ADCY9基因與吉西他濱耐藥的關系，發(fā)現ADCY9基因在吉西他濱耐藥的肺腺癌樣本中明顯低表達，而在吉西他濱敏感的肺腺癌樣本中則高表達，此說明ADCY9基因的低表達可能與吉西他濱耐藥相關。為分析ADCY9基因介導引起吉西他濱耐藥的機制，我們獲得了ADCY9基因的共表達基因，發(fā)現該基因與SMAD6基因存在相似的表達，并且相關性分析也顯示ADCY9與SMAD6基因具有顯著相關性(P=5.6×10-27,R=0.44)。SMAD6作為一種重要的信號轉導因子和轉錄調控因子，主要負性調控TGF-β信號通路的激活。TGF-β信號通路具有抑癌和促癌雙重作用，近年來的研究表明，該信號通路與腫瘤耐藥性密切相關，MED12蛋白的缺失導致TGF-β信號通 路活化，從而導致癌細胞對TKIs類耐藥性產生，而TGF-β抑制劑聯合TKIs藥物，則可對抗癌細胞的TKIs耐藥[6-7]。此外，TGF-β信號通 路還可通過上調PKCa的表達增強耐藥，也可通過誘導ET-1、OCT4等因子的表達，促進EMT而產生耐藥[8]。綜上，我們推測ADCY9基因的低表達可能是介導吉西他濱肺腺癌耐藥的重要分子之一，低表達的ADCY9基因是否也是通過活化TGF-β信號通 路產生耐藥，此需要進一步的實驗證實。

為進一步明確ADCY9介導吉西他濱肺腺癌耐藥的分子機制，本項目對獲得的共表達基因，進行基因功能與信號通路聚類分析，結果發(fā)現ADCY9基因的功能可能涉及肌醇磷酸化、放射反應、MAPKK活化、鈣離子負性轉運、蛋白磷酸化負性調控、細胞生長負性調控等生物學過程，以及Rho蛋白及G蛋白偶聯受體(GPCR)等信號通路。上述共表達基因聚類生物過程事件中，許多均與腫瘤耐藥有關，例如MAPKK(Raf)的激活可削弱化療藥的抗腫瘤 效果,成為產生耐藥的一個重要原因[9]；Rho蛋白家族中RhoA、RhoB及RhoE等均與腫瘤耐藥的產生有關[10-11]； GPCR則是目前最為成功的藥物靶標家族，目前40%以上的上市藥物以GPCR為靶點，PI3K/Akt 是GPCR下游的主要效應因子，而PI3K/Akt 信號通路 可通過多種機制引起腫瘤的多藥耐藥[12-13]。基于上述共表達基因分析，我們推測吉西他濱肺腺癌耐藥機制可能與Rho蛋白、G蛋白偶聯受體介導的MAPKK(Raf)、PI3K/Akt等信號通路相關，ADCY9基因的下調表達在Rho、Raf、PI3K/Akt等因素介導的耐藥機制中究竟扮演什么角色？此需要進一步的實驗證實。