腦缺血再灌注損傷中關(guān)鍵蛋白的研究進(jìn)展

孟文靜，陳真

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

腦血管疾病是一種常見的臨床疾病，其中以腦缺血性卒中最為常見，缺血性卒中是世界上導(dǎo)致死亡的第三大原因，其并發(fā)癥包括偏癱，昏迷甚至死亡?；謴?fù)缺血區(qū)域的腦灌注并盡快挽救缺血半影中的神經(jīng)元是腦梗死治療的核心問題。然而，供應(yīng)給缺血區(qū)域血液的恢復(fù)也可能誘發(fā)進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，這被稱為缺血再灌注(I/R)損傷[1]。研究表明，72%的缺血再灌注損傷是由再灌注損傷引起的，在幾種動物缺血性中風(fēng)模型中，缺血后長時間再灌注可導(dǎo)致比永久性血管結(jié)扎更嚴(yán)重的腦梗死[2]。因此，減少腦I/R損傷已成為缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵。

目前研究腦缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全明確，但可以確定的是與自由基生成，腦能量衰竭，腦血屏障(BBB)損傷，炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。相對應(yīng)的一些興奮性氨基酸調(diào)控藥物、自由基清除劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子、鈣離子拮抗劑、一氧化氮合酶抑制劑、抗凋亡藥物在臨床得到廣泛研究和應(yīng)用。因此尋找腦缺血再灌注中的關(guān)鍵蛋白，研發(fā)靶點(diǎn)藥物已成為治療缺血性腦損傷的關(guān)鍵一步。

1 Notch1信號通路

Notch基因于1917年由托馬斯·亨特·摩根(Thomas Hunt Morgan)發(fā)現(xiàn)，是一種普遍存在的信號通路，在小鼠和人類中，存在4種Notch受體和5種Delta/Serrate/Lag2(DSL)配體，其被稱為Jag1和Jag2和Delta樣(Dll)，Dll3和Dll4。該通路通過直接細(xì)胞-細(xì)胞相互作用激活，促進(jìn)信號細(xì)胞上Notch配體(Dll1、Dll3、Dll4、Jagged-1和Jagged-2)與相應(yīng)細(xì)胞上的Notch受體之間的結(jié)合。配體結(jié)合后，Notch被γ-分泌酶和腫瘤壞死因子α(TNF-α)切割以釋放受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，其易位至細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸依賴性通訊、細(xì)胞分化、增殖和凋亡參與許多關(guān)鍵生理學(xué)和病理過程[3]。

該途徑除在胚胎發(fā)育有重要作用外，在脊椎動物和無脊椎動物的成熟大腦中也顯示出關(guān)鍵功能，包括神經(jīng)祖細(xì)胞調(diào)節(jié)，神經(jīng)元連接，突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶。Notch信號傳導(dǎo)抑制許多生物體中的神經(jīng)分化，抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育并刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。Notch也是發(fā)育階段神經(jīng)干細(xì)胞維持和自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)退行性疾病中受到異常調(diào)節(jié)[4]，是發(fā)育階段神經(jīng)干細(xì)胞維持和自我更新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]，在神經(jīng)祖細(xì)胞分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的炎癥反應(yīng)中起重要作用。

研究表明，缺血/缺氧預(yù)處理可以增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，而VEGF是Notch1信號通路的上游[6]。Guan等[7]在研究中，建立了大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型，發(fā)現(xiàn)MCAO/R可引起腦梗死，海馬神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，并激活Notch1信號通路。Shi等[8]的研究表明，miR-137通過靶向Notch1來調(diào)節(jié)Notch信號通路以保護(hù)神經(jīng)元免受OGD / R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。Yan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)天然香豆素衍生物蛇床子素(Ost)上調(diào)基因Notch 1和Hes 1的表達(dá)，當(dāng)Notch活性被γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷時，Notch 1和Hes 1 mRNA的表達(dá)下調(diào)。因此，在腦缺血治療研究中，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可作為重要靶點(diǎn)。

2 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路

Akt是一種57kDa的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑的主要已知效應(yīng)物。其以低活性形式位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞被細(xì)胞外信號(例如缺血或缺氧)刺激時，Akt的C末端Ser 473殘基被磷酸化激活以調(diào)節(jié)上游分子，參與涉及許多生物過程的多種信號傳導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞存活、凋亡、增殖和分化。PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑是將細(xì)胞膜受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)信號的重要模式，近年來，PI3K/Akt細(xì)胞存活信號通路在腦損傷領(lǐng)域得到越來越多的研究，該途徑的激活在炎癥、血栓形成和血管通透性方面具有抑制作用，從而產(chǎn)生保護(hù)血管功能。Akt在缺氧缺血后作為腦中的存活激酶，通過磷酸化其底物以防止炎癥和細(xì)胞凋亡而起到存活激酶的作用。許多化合物(如生長因子、雌激素、自由基清除劑和其他神經(jīng)保護(hù)劑)通過上調(diào)p-Akt來減少缺血性損傷。研究證實(shí)，PI3K/Akt信號通路也是參與腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的主要途徑之一[10]。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是由兩種同種型GSK-3α和GSK-3β組成的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt最重要的下游靶標(biāo)之一就是GSK-3β，GSK-3β中第9位絲氨酸的磷酸化抑制GSK-3β的活性。在神經(jīng)元中，GSK3β參與神經(jīng)元微管動力學(xué)，并通過磷酸化其下游靶標(biāo)來調(diào)節(jié)未成熟神經(jīng)突的延伸和回縮，在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動、凋亡和炎癥方面有重要作用。而活化的Akt通過與GSK-3β結(jié)合，誘導(dǎo)GSK-3β易位至細(xì)胞膜，使N-末端Ser活性位點(diǎn)磷酸化，從而使GSK-3β失活，抑制GSK-3β活性[11]。GSK3β活性的增加與神經(jīng)元凋亡的增加相關(guān)，并且GSK3β活性的增加先于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，添加抑制性GSK3β結(jié)合蛋白或失活形式的GSK3β可降低凋亡水平[12]。

Zhang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚(KF)的心臟保護(hù)是通過對Akt/GSK-3β信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用的。Wang等[14]在研究一種人參皂苷(HN)的變體HNG時，發(fā)現(xiàn)其治療改善了小鼠實(shí)驗(yàn)性ICH后的功能和形態(tài)學(xué)結(jié)果，并且與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。PI3K/AKT/GSK-3β信號通路可作為腦缺血治療研究中一重要通路。

3 PI3K/AKT/mTOR信號通路

mTOR是雷帕霉素在哺乳動物細(xì)胞中的分子靶標(biāo)，是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR蛋白以兩種形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTOR是細(xì)胞生長和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，增加mTOR活性可減弱自噬并恢復(fù)細(xì)胞中溶酶體的完整性。磷酸化形式的Akt和mTOR在PI3K/Akt/mTOR途徑的細(xì)胞保護(hù)中起主要作用，激活PI3K/Akt/mTOR可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用[15]。

有證據(jù)表明，阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路可能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制增殖的關(guān)鍵途徑[16]。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與機(jī)械損傷后神經(jīng)元的凋亡，并可通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)途徑與自噬的起始密切相關(guān)。 Akt的下游磷酸化可以激活TSC1/2，其進(jìn)一步促進(jìn)mTOR活化。mTOR通過抑制下游分子復(fù)合物ULK1來負(fù)調(diào)節(jié)自噬水平。

Pan等[17]發(fā)現(xiàn)黃角顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的保護(hù)作用可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活有關(guān)，其對模型組大鼠腦組織IL-10、PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)均有明顯的上調(diào)作用，IL-1β和TNF-α在腦組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯(TP)也通過PI3K/Akt/mTOR通路產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

4 JAK2/STAT3

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)蛋白包含在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子家族之中，其參與細(xì)胞因子，生長因子和激素信號傳導(dǎo)之后的分化、增殖、存活、凋亡和血管生成。 STATs由酪氨酸磷酸化激活，酪氨酸磷酸化通常是瞬時并且緊密調(diào)節(jié)過程。STAT可根據(jù)其特定功能分為兩組：一種由STAT2、STAT4和STAT6組成，它們被少量細(xì)胞因子激活，并在T細(xì)胞發(fā)育和γ-干擾素(IFNγ)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。另一組包括STAT1、STAT3和STAT5，它們通過一系列配體在不同組織中激活，并參與IFN信號傳導(dǎo)、乳腺發(fā)育和胚胎發(fā)生，在控制細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡中也起重要作用，受體相關(guān)酪氨酸激酶JAK家族由4個成員組成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它們以受體二聚化或寡聚化的方式以部分特異性方式激活。STAT3被磷酸化-JAK2(pJAK2)磷酸化并隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核通過與含有γ-激活序列的基因的啟動子區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。JAK/STAT信號通路還可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，如增殖、生長、分化、遷移和侵襲[19]。研究表明，JAK2 /STAT3信號通路在氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞和動物模型中被激活[20]，一旦發(fā)生缺血性卒中，p-STAT3的表達(dá)顯著增加。

多項(xiàng)研究表明，激活JAK2/STAT3信號通路對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[21-23]。Hou等[24]研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過激活JAK2/STAT3間接上調(diào)PI3K/AKT/mTOR通路，增加BCL-2的表達(dá)但降低缺血/再灌注時BAX和切割的caspase-3表達(dá)，減少TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。銀杏內(nèi)酯(GK)通過JAK2/STAT3途徑增加HIF-1α/VEGF的表達(dá)促進(jìn)缺血性腦卒中后血管新生[25]。

5 TLR4/NF-κB信號通路

小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是腦組織中的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，而免疫系統(tǒng)中主要的受體類型是Toll樣受體(TLRs)。Toll樣受體(TLRs)是跨膜蛋白的一員，是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，是哺乳動物中唯一將細(xì)胞外抗原信息轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的分子。所有TLR中，Toll樣受體4(TLR4)是TLR中首個被發(fā)現(xiàn)的，它是一種富含亮氨酸的跨膜蛋白，通過識別和結(jié)合多種內(nèi)源和外源配體在免疫防御和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，TLR4通過膜轉(zhuǎn)導(dǎo)這些信號，隨后調(diào)節(jié)其表達(dá)。TLR4刺激絲裂原活化蛋白(MAP)和應(yīng)激激酶，如細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2，p38和Jun激酶(JNK)1/2，進(jìn)而激活核內(nèi)炎癥的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[26]。

研究表明，在缺血或缺血再灌注損傷后，腎小管上皮細(xì)胞和腎臟白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TLR4的上調(diào)[27]。TLR4也在肝臟、肺臟和心臟的缺血再灌注炎癥損傷中起作用，并在腦缺血再灌注中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TLR的激活通常導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位，NF-κB是一種廣泛使用的轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性結(jié)合許多基因的啟動子和增強(qiáng)子，從而參與多種細(xì)胞功能，如炎癥、免疫反應(yīng)、血液生成、細(xì)胞增殖和凋亡。NF-κB活化導(dǎo)致表達(dá)不同的促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-8，因此抑制腦NF-κB活化與神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。TLR4信號通路的下調(diào)或表達(dá)下調(diào)可能在缺血模型中發(fā)揮保護(hù)作用。

Han等[28]通過建立MCAO模型，發(fā)現(xiàn)針刺可以通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR4/NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)MCAO大鼠的炎癥反應(yīng)。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)，N-丁基苯酞(NBP)其通過TLR4/NF-κB抑促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，包括IL-6、IL-1β和TNF-α，從而在阿爾茨海默病和中風(fēng)動物模型中具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。同樣的，Liu等[30-31]研究表明，抑制TLR4/NF-κB信號通路可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

6 JNK

神經(jīng)細(xì)胞死亡機(jī)制的重要組成部分是激酶的混合譜系激酶(MLK)家族，其激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑至神經(jīng)元細(xì)胞死亡。MLK3是MLK家族的成員，MLK3磷酸化并激活MAPKK，包括MKK4和MKK7，其反過來激活JNK的Thr-183和Tyr-185殘基，體外研究表明，MKK4可以激活JNK和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[32]。腦卒中時神經(jīng)細(xì)胞凋亡在腦I/R損傷誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中起重要作用，在缺血和再灌注損傷中，自由基通過靶向多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑也在缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)理中起重要作用。C-JNK作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員，有助于細(xì)胞凋亡。如抑制JNK/AP-1途徑顯示改善新生兒缺氧缺血性腦損傷[33]。

JNK家族有3種亞型，包括JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在大多數(shù)組織中表達(dá)，JNK3選擇性地存在于心臟和大腦中。磷酸化的JNK3激活核中的底物c-Jun，活性c-Jun可誘導(dǎo)凋亡蛋白的表達(dá)，在凋亡細(xì)胞的死亡中起關(guān)鍵作用。腦缺血/再灌注促進(jìn)谷氨酸受體介導(dǎo)的JNK3信號傳導(dǎo)途徑的激活。JNK參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制，例如中風(fēng)，動脈粥樣硬化，阿爾茨海默氏癥和帕金森病，在炎癥、細(xì)胞凋亡和壞死的信號通路中發(fā)揮重要作用，并調(diào)節(jié)缺血和再灌注過程中神經(jīng)元和心肌細(xì)胞損傷中涉及的幾個轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄過程[33]。研究發(fā)現(xiàn)，JNK磷酸化和JNK依賴性通路激活在大鼠和小鼠全腦和局灶性腦缺血后發(fā)生，JNK的激活加重了中風(fēng)的腦損傷，引起炎癥并導(dǎo)致缺血性細(xì)胞死亡[34]。缺血再灌注(I/R)可顯著增強(qiáng)海馬CA1區(qū)JNK3的磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。Wen等[35]研究發(fā)現(xiàn)，研究表明丁基苯酞可顯著增加I/R誘導(dǎo)的腦損傷后CA1錐體神經(jīng)元的存活并抑制JNK/caspase-3信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Duan等[36]研究表明苦瓜多糖阻止了由腦內(nèi)出血損傷引起的JNK3、c-Jun和caspase-3的激活，對腦內(nèi)出血具有神經(jīng)保護(hù)作用。

7 DAPK1

死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)是一種介導(dǎo)細(xì)胞死亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有獨(dú)特的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包含激酶結(jié)構(gòu)域，鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)區(qū)段，8個錨蛋白重復(fù)序列，細(xì)胞骨架結(jié)合區(qū)域和死亡結(jié)構(gòu)域，其在腦缺血后mRNA水平增加。DAPK在正常腦組織中是無活性的，其處于磷酸化狀態(tài)并且伴隨于體內(nèi)缺血而快速且持續(xù)地去磷酸化和活化。DAPK在腦缺血后被去磷酸化并被激活。這種活化可以通過磷酸酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抑制劑FK506或原代皮層神經(jīng)元中的選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801來抑制。其在神經(jīng)元發(fā)育以及損傷恢復(fù)中起作用，在受影響的海馬半球的上調(diào)。在發(fā)育中和成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DAPK1 mRNA在大腦皮層和海馬內(nèi)的增殖區(qū)廣泛表達(dá)。此外，DAPK1主要參與神經(jīng)元發(fā)育和損傷恢復(fù)過程，它的活性隨著缺氧缺血而增加。

細(xì)胞培養(yǎng)模型已證明DAPK參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元損傷后DAPK表達(dá)增加，在腦缺血動物模型中的組織損傷區(qū)域中mRNA水平增加[37]。DAPK的小分子抑制劑烷基化3-氨基-6-苯基噠嗪顯著減輕缺血性中風(fēng)后的腦損傷，抑制DAPK去磷酸化有助于缺血小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用[38]。Pei等[39]研究發(fā)現(xiàn)，DAPK1直接磷酸化Ser262上的Tau蛋白，導(dǎo)致中風(fēng)后皮層神經(jīng)元的脊柱損傷，小鼠中DAPK1激酶結(jié)構(gòu)域(KD)的遺傳缺失(DAPK1-KD(-/-))或阻斷DAPK1-Tau相互作用可保護(hù)脊柱損傷并改善針對中風(fēng)損傷的神經(jīng)功能。

8 NLRP3炎性體蛋白

近年來對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)的研究越來越多，包括NLRP3、NLRP1、NLRC4和AIM2。其中，NLRP3作為先天免疫中重要的模式識別受體，因參與缺血后的炎癥反應(yīng)而受到關(guān)注。NLRP3炎性體主要在免疫器官和免疫細(xì)胞中表達(dá)，是細(xì)胞中的多蛋白復(fù)合物，具有NLRP3、caspase-1和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)3個結(jié)構(gòu)域作為核心蛋白。其主要功能是識別外源性感染和各種致病微生物內(nèi)傷的風(fēng)險信號，介導(dǎo)caspase-1的活化，將pro-IL-β加工成熟的活性形式，在細(xì)胞外分泌，從而激活天然免疫反應(yīng)，導(dǎo)致多級炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。有研究表明，過度炎癥反應(yīng)在腦缺血的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，因此，靶向炎癥可能是預(yù)防和治療腦損傷的重要治療策略。NLRP3在受氧-葡萄糖剝奪(OGD)或模擬缺血再灌注(I/R)的原代皮層神經(jīng)元中的表達(dá)。I/R損傷可以誘導(dǎo)腦I/R小鼠和中風(fēng)患者的同側(cè)腦組織中NLRP3炎性體蛋白，IL-1β和IL-18的表達(dá)增加。

Yu等[40]發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素通過抑制NLRP3炎性體激活而對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時，NLRP3的有效調(diào)節(jié)或抑制有助于預(yù)防或治療缺血性中風(fēng)或糖尿病。Hong等[41]用NLRP3特異性抑制劑，改善了腦缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠。因此抑制NLRP3可以預(yù)防腦缺血再灌注損傷，NLRP3炎性體可能成為治療缺血性中風(fēng)的潛在藥物靶標(biāo)。

9 總結(jié)

由腦缺血再灌注引起的腦損傷死亡率在逐年上升，而腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的、多種通路參與的過程，目前用于治療缺血性腦損傷的主要治療方法旨在實(shí)現(xiàn)再灌注，神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)恢復(fù)，因此找到合適的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行研究是當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。本文通過對近幾年研究熱點(diǎn)的靶蛋白進(jìn)行綜述，以期為腦缺血再灌注損傷提供系統(tǒng)的研究思路。