柴胡屬藥用植物多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

張全芳，范陽(yáng)陽(yáng)，劉艷艷，陳雪燕，譚晴晴，胡悅，劉國(guó)霞，汪冰，林永強(qiáng)*，步迅*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

柴胡，是傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(BupleurumL.)植物的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名茈胡，列為上品。至《本草圖經(jīng)》始易其名為柴胡[1]。具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效，為中醫(yī)治療少陽(yáng)癥的首選要藥[2]?！吨袊?guó)藥典》2015年版規(guī)定柴胡來(lái)源于柴胡(BupleurumchinenseDC.)和狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)，分別習(xí)稱為北柴胡和南柴胡。藥用柴胡植物主要是來(lái)自25種、8個(gè)變種、3個(gè)變型的傘形科(Belliferae)芹亞科(Apioideae)柴胡屬(Bupleurum)的植物[3-4]。柴胡在我國(guó)有著兩千多年藥用歷史，是最常用的大宗藥材之一，但柴胡屬植物眾多，分布廣泛，在產(chǎn)地均作藥用，導(dǎo)致柴胡藥材品種混雜，藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定[5]。常見的混偽品如黑柴胡(BupleurumsmittiWolff.)、銀州柴胡(BupleurumyinchwensenShan et Y Li)、柴首(BulpeurumchaishouiShan et Sheh)、大葉柴胡(BupleurumlongiradiatumTurcz.)、秦嶺柴胡(BupleurumlongicauleWall wx DC.Var.Giraldii Wolff.)[6]。

目前，柴胡的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征或其中的化學(xué)成分柴胡皂苷a、d加以區(qū)分，但是由于柴胡屬植物在形態(tài)、組織上差別不大，且受產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間、加工方法等諸多可變因素的影響，同一種柴胡的生藥鑒別特征也會(huì)變化，更增加了鑒別的難度[7]。僅用性狀、顯微及理化鑒別方法較難準(zhǔn)確的區(qū)分市場(chǎng)上的柴胡品種，因此，建立更加可靠的柴胡鑒別方法對(duì)于保證柴胡藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些基于DNA的生物學(xué)鑒定手段逐漸豐富起來(lái)，與傳統(tǒng)分析方法相比，DNA分子法更加客觀和準(zhǔn)確。目前柴胡鑒別的分子手段主要是DNA條形碼技術(shù)，通過DNA測(cè)序手段比較柴胡的ITS序列進(jìn)行鑒別操作復(fù)雜，儀器配套成本高，局限性大。近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，并使得成分含量的定量溯源成為可能[8]，因此，本研究基于ITS2序列建立的南柴胡、北柴胡及偽品柴胡多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系將能更加準(zhǔn)確、靈敏和快速地檢測(cè)對(duì)應(yīng)源性成分。

1 材料與方法

1.1 供試材料 北柴胡、南柴胡、竹葉柴胡標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；銀州柴胡、小葉黑柴胡、錐葉柴胡、膜緣柴胡、藏柴胡、窄竹葉柴胡、白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、川貝、枸杞等中藥來(lái)自山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.2 試劑與儀器 植物DNA提取試劑盒DNA分子量Marker DL2000、電泳上樣緩沖液等PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物與探針由生工生物工程(上海)有限公司負(fù)責(zé)合成。2×TaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。 DNA測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序中心完成。

ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司)；Takara PCR儀[寶生物工程(大連)有限公司]；5424 D型高速離心機(jī)(Eppendorf公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針的設(shè)計(jì) ITS2 序列是介于5.8S和28S rRNA 基因之間的非編碼序列，因其在核糖體rDNA 整體結(jié)構(gòu)功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有較高的可變性，其序列在不同種類、或同種的不同個(gè)體中都可能存在較大差異，因此，利用ITS2 序列作為南、北柴胡鑒定靶基因具有既簡(jiǎn)明又可靠的特性。通過比對(duì)南、北柴胡ITS2序列特征，設(shè)計(jì)南、北柴胡的特異性引物和探針，以及柴胡的通用引物及通用探針(見表1)。

表1 引物與探針序列

1.3.2 柴胡干根DNA的提取 用無(wú)菌手術(shù)刀切片刮棄表皮，剪碎混合，取80 mg置于滅菌研缽中，液氮快速研磨。采用CTAB[9]法提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。

1.3.3 單重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立 通過對(duì)單一熒光定量PCR反應(yīng)體系中的Taq酶用量、引物濃度、探針濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了南柴胡、北柴胡的單重?zé)晒舛縋CR方法。其中上下游引物以1.0、2.0、5.0、10.0 μmol·L-1為濃度梯度，探針濃度在0.1～5.0 μmol·L-1之間，以1.0 μmol·L-1梯度遞增，每個(gè)濃度梯度做5個(gè)平行樣，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，58 ℃ 35 s(收集熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。在體系中引物和探針濃度優(yōu)化后將退火溫度設(shè)置為56～66 ℃,以2 ℃為一個(gè)梯度，共6個(gè)退火溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，同一模板5個(gè)平行樣的3次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)擴(kuò)增所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，除了以產(chǎn)生Ct值最小、熒光信號(hào)強(qiáng)度最高和Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小綜合指數(shù)最高為依據(jù)外，還要考慮既保證擴(kuò)增效率的同時(shí)又要確保探針的特異性等條件，最終確立最佳的退火溫度。

1.3.4 多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立 在單一熒光PCR建立的最優(yōu)體系和確保試驗(yàn)特異性及穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，在同一反應(yīng)體系中加入南柴胡、北柴胡通用引物和特異探針與柴胡通用引物與通用探針，并根據(jù)閾值(即Ct值)和熒光增量，對(duì)各引物、探針濃度及循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系和方法。

1.3.5 多重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn) 分別從北柴胡、南柴胡、銀州柴胡、小葉黑柴胡、錐葉柴胡、竹葉柴胡、膜緣柴胡、藏柴胡、窄竹葉柴胡、白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、川貝、枸杞等植物的藥用部位提取基因組DNA為模板，按照上述優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)引物和探針的特異性。

1.3.6 多重實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn) 將南、北柴胡的基因組DNA定量到50 ng，按5×梯度稀釋，每個(gè)梯度均取2.0 μL為模板量，(即：10、2、0.4、0.08、0.016 ng)，將每組檢測(cè)設(shè)立3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次，每次試驗(yàn)的結(jié)果一致才能確定該方法的檢測(cè)限靈敏度。

1.3.7 實(shí)際樣品檢測(cè) 利用建立的多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)檢局提供的46份柴胡樣品進(jìn)行柴胡成分檢測(cè)，并與DNA測(cè)序法進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證方法的使用價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 單重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立 最佳反應(yīng)體系為20 μL，2×TaqmanMaster mix 10.0 μL，對(duì)引物濃度、探針濃度和退火溫度的優(yōu)化。確定最佳引物濃度為10.0 μmol·L-1，南柴胡探針終濃度為5.0 μmol·L-1，北柴胡探針終濃度為0.4 μmol·L-1，通用探針終濃度為2.0 μmol·L-1。

2.2 多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立 通過優(yōu)化引物濃度和探針濃度，確定最佳引物混合物終濃度為10.0 μmol·L-1，探針混合物終濃度為5.0 μmol·L-1，總反應(yīng)體系為20 μL，包括2×TaqmanMaster mix 10.0 μL，Primer Mix(10.0 μmol·L-1)1.0 μL，Probe Mix(5.0 μmol·L-1)1.0 μL，DNA Template(1～20 ng·μL-1)2.0 μL，ddH2O 6.0 μL(見表2)。PCR反應(yīng)最佳反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；{95 ℃10 s；65 ℃35 s} 40個(gè)循環(huán)，在此收集信號(hào)。

表2 南柴胡、北柴胡引物及探針特異性試驗(yàn)

注：N 代表Negative，陰性

2.3 多重?zé)晒釶CR特異性試驗(yàn) 按照“1.3.7”項(xiàng)下的方法針對(duì)南柴胡與北柴胡的引物和探針進(jìn)行特異性檢測(cè)，當(dāng)FAM、ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足Ct≤35說(shuō)明待檢樣本檢出北柴胡成分(見圖1A);當(dāng)JOE、ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線，且滿足Ct≤35說(shuō)明待檢樣本檢出南柴胡成分(見圖1B)；當(dāng)只有ROX熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線，且滿足Ct≤35說(shuō)明待檢樣本為偽品柴胡(見圖1C)。另外，通過表2可以看出北柴胡和南柴胡源性成分均獲得擴(kuò)增曲線且Ct值，而其他樣本沒有擴(kuò)增。綜上表明，北柴胡和南柴胡的引物和探針具有很好的物種特異性。

2.4 多重?zé)晒釶CR靈敏度試驗(yàn) 分析結(jié)果顯示：當(dāng)南柴胡模板量為0.08 ng時(shí)，有擴(kuò)增曲線且Ct值<35,當(dāng)模板量為0.016 ng時(shí)，有擴(kuò)增曲線但Ct值>35；當(dāng)北柴胡模板量為0.08 ng時(shí)，有擴(kuò)增曲線且Ct值<35，當(dāng)模板量為0.016 ng時(shí)，無(wú)擴(kuò)增曲線；因此，南、北柴胡的定量檢測(cè)限為0.08 ng(見圖2)。

圖1 南、北柴胡特異性擴(kuò)增曲線圖

圖2 南柴胡、北柴胡靈敏度擴(kuò)增曲線圖

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè) 利用本試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)46份柴胡樣品。其中17份檢出北柴胡源性成分，5份為南柴胡，其他樣品均檢測(cè)為偽品柴胡。與DNA測(cè)序法結(jié)果一致，表明本方法具有一定的使用價(jià)值。

3 討論

目前用DNA分子標(biāo)記鑒定柴胡大部分是通過提取柴胡幼嫩組織，而柴胡入藥部分多為含有大量次生代謝產(chǎn)物的莖或干根，并且經(jīng)過進(jìn)一步加工和炮制，這就為柴胡DNA的提取帶來(lái)了困難。此外，在實(shí)際應(yīng)用方面多數(shù)研究也沒有獲得柴胡特有的分子標(biāo)記。因此，傳統(tǒng)的鑒別方法不能滿足當(dāng)前市場(chǎng)對(duì)柴胡真?zhèn)舞b定的需求，而通過改進(jìn)的柴胡基因組提取方法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測(cè)能很好地解決這類問題。王亞丹等[10-12]發(fā)現(xiàn)，基于ITS2序列可以準(zhǔn)確可靠地鑒別柴胡藥材及其混偽品。本研究通過比較南、北柴胡的ITS2序列，設(shè)計(jì)并篩選得到特異PCR引物和TaqMan探針，通過優(yōu)化體系和條件，建立了南、北柴胡多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系，能夠快速鑒定柴胡及其制品中南柴胡、北柴胡源性成分。在柴胡生產(chǎn)加工質(zhì)量監(jiān)控及監(jiān)管部門監(jiān)管中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。