柚皮苷和柚皮素對HepaRG細胞核受體蛋白表達的影響

樊威洋，吳灝，王永剛，蘇薇薇，何鄉(xiāng)，李沛波

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

核受體是一種配體依賴性結合后激活的轉錄因子，屬于生物體內(nèi)轉錄因子超家族成員之一。核受體能被特異性的配體激活或抑制，參與細胞內(nèi)轉錄水平調(diào)控，在信號轉導、細胞分化、細胞凋亡、細胞代謝和細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理過程調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[1]。肝臟中核受體表達與肝臟疾病密切相關，核受體及其轉錄協(xié)同因子本身或受其調(diào)控的靶基因表達的紊亂是導致肝臟代謝失衡及肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝纖維化和肝癌等肝臟疾病發(fā)病的重要因素之一[2]。芳香烴受體(AhR)、孕烷X受體(PXR)、組成型雄甾烷受體(CAR)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)參與肝臟中多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)轉運、代謝和清除[3]。有文獻表明，AhR基因敲除小鼠會出現(xiàn)肝重量降低、短暫的肝臟微血管脂肪變等發(fā)育異常[4]以及肝血管過度增殖[5]等現(xiàn)象；AhR也被認為是包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的藥物靶標[6]。PXR可通過蛋白磷酸化機制，影響肝癌細胞的形態(tài)和遷移能力[7]。CAR的激活能使脂質(zhì)分解物質(zhì)代謝基因(CPT1A、HMG-CoA)表達降低，而使脂質(zhì)合成基因(SCD1)表達增高，從而引發(fā)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)[8-9]。PPARα可通過上調(diào)肝脂肪酸結合蛋白的轉錄表達來增加高密度脂蛋白，并降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白，也參與介導的線粒體脂肪酸氧化誘導[10]。

柚皮苷(naringin)是一種二氫黃酮糖苷，由苷元柚皮素(naringenin)在C-7處結合新橙皮糖所形成，主要存在于蕓香科柑橘屬水果的果皮和果肉中，亦是中藥枳實、枳殼、化橘紅的主要有效成分之一，柚皮苷進入體內(nèi)后，小部分可以被小腸直接吸收入血，大部分由腸道微生物水解為柚皮素，繼而經(jīng)腸道吸收入血[11]。文獻表明，柚皮苷和柚皮素既能調(diào)節(jié)肝臟代謝平衡，降低肝臟氧化損傷，也具有抗肝炎、抑制肝癌細胞增殖遷移、抗肝纖維化等作用[12-13]。然而，柚皮苷、柚皮素對肝臟中核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的影響尚未見文獻報道。本實驗采用免疫印跡法，考察柚皮苷、柚皮素對人肝癌細胞HepaRG中AhR、PXR、CAR和PPARα 4種核受體蛋白表達的影響，為研究柚皮苷、柚皮素防治肝臟疾病的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌HepaRG細胞株，購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2 主要藥物與試劑 柚皮苷、柚皮素和DMSO(純度>98%，德國Sigma-Aldrich公司)；利福平(Rifampicin，純度>98%，上海Aladdin公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime公司)； HRP偶連抗兔二抗(美國Promega公司)； Anti-AhR抗體(ab190797)、Anti-PXR抗體(ab85451)、Anti-CAR抗體(ab62590)、Anti-PPARα抗體(ab24509)和重組Anti-GAPDH抗體(ab181602)均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器 HERAcell VIOS 160i型CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Arium mini超純水系統(tǒng)(德國Sartorius公司)；多孔超微量核酸蛋白分析儀Epoch(美國Biotek公司)；通用電泳電源、小型垂直電泳槽、Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白轉印儀(美國Bio-rad公司)；Tanon 5200天能化學發(fā)光成像系統(tǒng)(中國Tanon公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用完全RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%胎牛血清、1%青鏈霉素)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)人肝癌HepaRG細胞，每隔2 d對細胞換液，細胞生長占據(jù)培養(yǎng)底面積80%以上時使用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 藥物配制與細胞處理 稱取柚皮苷、柚皮素和利福平，以DMSO溶解并用0.22 μm濾頭過濾除菌，配置成終濃度為10、30和100 mmol·L-1的柚皮苷、柚皮素母液和50 mmol·L-1的利福平母液。

取對數(shù)生長期的HepaRG細胞，均勻接種于六孔板中培養(yǎng)過夜，分別以含不同濃度柚皮苷(10、30、100 μmol·L-1)、柚皮素(10、30、100 μmol·L-1)或利福平(50 μmol·L-1)的培養(yǎng)基處理24 h或48 h。

2.3 總蛋白提取 藥物處理結束，使用RIPA裂解液裂解HepaRG細胞15 min，劇烈渦旋振蕩5 min后，于4 ℃條件下以12 000 rcf離心20 min，棄去底部細胞碎片沉淀，收集上清即為HepaRG細胞總蛋白。

2.4 蛋白免疫印跡法

2.4.1 蛋白樣品制備和SDS-PAGE凝膠配置 采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定HepaRG細胞總蛋白濃度，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和PBS稀釋總蛋白至1 μg·μL-1，煮沸10 min，上樣。

2.4.2 蛋白上樣電泳和轉膜 每孔的總蛋白上樣量為20 μg，80 V恒壓電泳10 min后轉為250 V恒壓電泳25 min。甲醇浸泡活化0.2 μm PVDF膜后，用半干轉轉膜液浸泡平衡濾紙和PVDF膜30 min，使用Trans-Blot Turbo全能型半干蛋白轉印儀2.5 A恒流半干轉17 min。

2.4.3 封閉、抗體孵育與檢測 轉膜結束后用TBST洗膜3次，每次5 min；用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h；再用TBST洗膜3次，每次15 min；加入含有對應一抗的孵育液，于4 ℃孵育過夜，取膜用TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗孵育液，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次15 min。以ECL高敏發(fā)光液孵育10 s，使用Tanon 5200天能化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測。

3 結果

柚皮苷、柚皮素對人肝癌HepaRG細胞中AhR、PXR、CAR和PPARα這4種核受體蛋白水平的影響結果見圖1～4。由圖1～2可見，柚皮苷、柚皮素處理人肝癌HepaRG細胞24 h后，與空白組相比，100 μmol·L-1柚皮素顯著抑制AhR和PXR蛋白的表達，但對CAR、PPARα蛋白表達沒有影響；50 μmol·L-1利福平顯著抑制AhR蛋白表達、促進CAR蛋白表達，但對PXR、PPARα蛋白表達沒有影響；其余給藥處理組的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達在統(tǒng)計學意義上沒有顯著性差異。由圖3、4可見，柚皮苷、柚皮素給藥處理人肝癌HepaRG細胞48 h后，與空白組相比，100 μmol·L-1柚皮素顯著抑制核受體AhR和PXR的蛋白表達，但對CAR和PPARα蛋白表達沒有影響；50 μmol·L-1利福平顯著抑制核受體AhR蛋白的表達，對CAR、PXR、PPARα蛋白表達沒有影響；其余給藥組的AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達在統(tǒng)計學意義上沒有顯著性差異。

圖1 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞24 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的Western blotting結果

圖2 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞24 h對核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相對表達量的比較(n=6)

圖3 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞48 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白表達的Western blotting結果

圖4 柚皮苷、柚皮素處理HepaRG細胞48 h后核受體AhR、PXR、CAR和PPARα蛋白相對表達量的比較(n=6)

4 討論

AhR作為一種與肝臟疾病密切相關的蛋白，參與生長因子信號傳導、凋亡基因表達、細胞周期和細胞因子表達的調(diào)控[14-15]，可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程[16]。臨床研究表明，AhR在肝癌組織中有高表達現(xiàn)象，而且與癌癥的惡性程度相關[17]，抑制AhR表達可能有利于肝癌的防治。PXR可調(diào)控多種藥物代謝酶和轉運體的表達，進而參與肝臟中脂質(zhì)、糖類物質(zhì)和臨床藥物的代謝，影響肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展進程[18]，大多數(shù)肝臟疾病中均可見PXR在肝細胞中表達和活性的上調(diào)[19-20]。過量服用對乙酰氨基酚(APAP)會激活PXR，靶向調(diào)節(jié)藥物代謝酶CYP450家族的表達，引起APAP藥物代謝過程中有毒代謝物N-乙酰對苯醌亞胺的大量積累，進而誘導氧化應激、DNA損傷和線粒體功能受損[21]。此外，利福平與異煙肼合用時，通過激活PXR來促進氨基乙酰丙酸合成酶Ⅰ的表達，增加膽汁中血紅素前體原卟啉Ⅸ的產(chǎn)生，從而造成肝損傷[22]。因此，抑制PXR表達在肝臟疾病藥物篩選與治療中具有潛在價值。

Zhou等[23]研究表明，柚皮苷能通過減輕脂質(zhì)積累、減少氧化應激和凋亡來抑制酒精誘導的斑馬魚肝損傷和脂肪變性。Arul等[24]研究表明，柚皮素能抑制N-亞硝基二乙胺誘導大鼠肝癌的發(fā)生和前期病變。Ahmed等[25]研究表明，柚皮苷和柚皮素能顯著改善APAP引起的肝組織細胞質(zhì)空泡化和炎性細胞浸潤，具有增強抗氧化防御并抑制炎癥和細胞凋亡的作用。

本實驗結果表明，100 μmol·L-1柚皮素能顯著下調(diào)HepaRG細胞AhR、PXR的蛋白表達，提示柚皮素可能可以通過抑制AhR和PXR的表達來發(fā)揮抗肝癌和肝損傷的作用。但是，在本實驗中，柚皮苷對AhR、PXR、CAR和PPARα這4種核受體蛋白均無顯著性影響，可能是因為柚皮苷極性較大而無法通過HepaRG細胞膜。本研究從核受體方面為柚皮苷、柚皮素防治肝臟疾病提供了一定的藥理學依據(jù)。