長白紅景天提取物抗氧化活性的研究

李承范， 張敬東， 王思宏

( 延邊大學 測試中心， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

長白紅景天(Rhodiolaangusta)為景天科紅景天屬多年生草本植物，其在吉林省主要分布在長白、安圖、撫松等地，而且數量較少[1].研究[2]表明，紅景天屬植物具有抗疲勞、抗衰老以及提高免疫能力等方面的藥理功效，因此引起了學者的廣泛關注.目前為止，有關長白紅景天的研究多見于指紋圖譜[3-4]、無機元素[5]、解剖學[6]、內生菌[7-8]、種群遺傳[9]等方面的研究，但對長白紅景天根莖提取物的抗氧化性能的研究未見報道；因此，本文對長白紅景天根莖提取物的抗氧化性能進行研究，以期為長白紅景天的藥用開發(fā)提供參考.

1 材料及方法

1.1 材料

長白紅景天采于安圖縣二道白河，并經長白山植物博物館鑒定；蘆丁，中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司生產； 1,1-二苯代苦味酰基自由基(1,1-dipenyl-2-picrylhydray,DPPH)、特丁基對苯二酚(Tertiary butylhydroquinone,TBHQ)、抗壞血酸(Vc)、二丁基羥基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)、三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(Tris-HCl 緩沖液)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)，Sigma公司生產；鄰二氮菲、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、鹽酸，天津科密歐化學試劑有限公司生產，且均為分析純.

1.2 主要儀器

U-3400型紫外分光光度計，Hitachi公司生產； sp210s型電子天平，北京賽多利天平有限公司生產； Q/BKYY31-200型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海青浦滬西儀器廠生產.

1.3 實驗方法

1.3.1總黃酮的提取 將乙醇濃度、浸提溫度、料液比、浸提時間作為影響總黃酮提取量的因素，利用正交試驗確定最佳提取條件，各實驗因素水平如表1所示.表2為總黃酮提取因素的正交實驗結果表.

表1 總黃酮提取因素水平

表2 總黃酮提取因素正交實驗結果

注：Ki表示任意列上水平號為i時所對應的試驗結果之和；ki是每列對應值之和的三分之一；R表示極差.

由表2可知，影響提取總黃酮的工藝因素依次為：提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時間.由此可知，提取長白紅景天時，加40倍長白紅景天質量的乙醇(體積分數為80%), 在95 ℃條件下加熱提取1 h，提取效果最佳.

1.3.2總黃酮含量的測定 稱取55 mg蘆丁置于50 mL容量瓶中，加入適量的乙醇(體積分數為70%)，微熱溶解后定容至50 mL，質量濃度為110 μg/mL.移取蘆丁溶液0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0、 4.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質量分數為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質量分數為10%)、4 mL氫氧化鈉溶液(質量分數為4%)，然后用乙醇溶液(體積分數為70%)定容至刻度.參比液為0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質量分數為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質量分數為10%)和4 mL氫氧化鈉溶液(質量分數為4%).在510 nm處，測量蘆丁溶液的吸光度.以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁溶液的標準曲線并得到濃度與吸光度的線性關系.線性回歸方程為：y=-0.008 19x+0.010 01，R2=0.994 5.

圖1 蘆丁溶液的標準曲線

用正交試驗得到的最佳條件提取長白紅景天(2 g) 2次，并合并提取液，過濾后轉至100 mL容量瓶中定容.取3份1 mL提取液分別置于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉溶液(質量分數為5%)、0.5 mL硝酸鋁溶液(質量分數為10%)、4 mL氫氧化鈉溶液(質量分數為4%)，搖勻后用乙醇溶液(體積分數為70%)定容至刻度.以蒸餾水為空白對照，在510 nm處測定提取液的吸光度.

1.3.3DPPH自由基的清除率測定 用移液管移取不同濃度提取液0.5 mL，加入1.5 mL乙醇(體積分數為70%)后置于10 mL試管中，再加入2.0 mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)； 充分混勻，靜置30 min后在517 nm條件下測定其吸光度Ai.將2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL乙醇(體積分數為70%)溶液混合，搖勻，靜置5 min后測定其吸光度Ac.將2 mL提取液(不同濃度)與2 mL乙醇溶液(體積分數為70%)混合，搖勻，靜置后測定其吸光度Aj.根據公式(1)計算提取物對DPPH自由基的清除率(RSRDPPH)，并在相同條件下計算TBHQ、Vc和BHT的DPPH自由基清除率.

(1)

1.3.4羥基自由基的清除率測定 取9支試管，依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、3.5 mL pH=7.4的PBS和1.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液.在其中的7支試管中，分別加入不同濃度的提取液0.5 mL，混勻，靜置.將剩余2支不加提取液的試管分別標記為損傷管和未損傷管，并在損傷管中加入1 mL體積分數為0.01%的雙氧水溶液(未損傷管中不加雙氧水溶液).再將9支試管用蒸餾水稀釋至10 mL， 37 ℃恒溫1 h后用同濃度提取液做參比液，在536 nm處測定吸光度.根據公式(2)計算提取物對羥基自由基的清除率(RSR·OH)，并在相同條件下計算TBHQ、Vc和BHT的羥基自由基清除率.

(2)

式中A2為未損傷管中溶液的吸光度，A1為損傷管中溶液的吸光度，A0為提取液的吸光度.

(3)

式中A0為加入提取液之前的鄰苯三酚自氧化的吸光度，A1為加入提取液之后的鄰苯三酚自氧化的吸光度.

2 結果與分析

2.1 總黃酮提取工藝優(yōu)化的結果分析

按照最佳提取工藝提取長白紅景天，測得所得提取物的總黃酮含量為3.74%,這與正交試驗設計中實驗8 (表2)接近，表明此工藝條件是合理、可行的.

2.2 長白紅景天提取物抗氧化性能的測試

1) 對DPPH自由基清除能力的考察.長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對DPPH自由基的清除能力如圖2所示.由圖2可以看出，在實驗濃度范圍內，長白紅景天提取物對DPPH自由基的清除率均保持在90%～95%之間，與Vc較為接近，且優(yōu)于TBHQ和BHT.

圖2 長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對DPPH自由基的清除率

2)對羥基自由基清除能力的考察.長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對羥基自由基的清除能力如圖3所示.由圖3可以看出，在實驗濃度范圍內，長白紅景天提取物對羥基自由基的清除率基本隨濃度的增加而增加，清除率保持在63%～100%之間；Vc、TBHQ和BHT在實驗濃度范圍內對羥基自由基的清除率保持在40%～60%之間.這說明，長白紅景天提取物對羥基自由基的清除活性優(yōu)于Vc、TBHQ和BHT.

圖3 長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對羥基自由基的清除率

3)對超氧陰離子自由基的清除能力的考察.長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對超氧陰離子自由基的清除能力如圖4所示.由圖4可以看出，在實驗濃度范圍內，長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對超氧陰離子自由基的清除率范圍分別為： 27%～50%、15%～32%、22%～32%、 21%～30%，這表明長白紅景天提取物在實驗濃度范圍內對超氧陰離子自由基的清除率優(yōu)于Vc、TBHQ和BHT.

圖4 長白紅景天提取物、Vc、TBHQ和BHT對超氧負離子自由基的清除率

3 結論

本文研究表明，長白紅景天提取物總黃酮提取工藝的最佳條件是加40倍長白紅景天質量的乙醇(體積分數為80%),在95 ℃條件下加熱提取1 h.在最佳工藝條件下，測得長白紅景天提取物中總黃酮的含量為3.74%.長白紅景天提取物在實驗濃度范圍內對3種自由基(DPPH、羥基、超氧陰離子)均有較好的清除能力，且對3種自由基的清除能力均優(yōu)于Vc、TBHQ和BHT.另外，長白紅景天提取物對DPPH的清除能力也優(yōu)于玫瑰紅景天(R.roseaL.)[10]：因此，長白紅景天是一種優(yōu)良的抗氧化活性的植物.本文在研究中未對提取物中的抗氧化單體化合物進行分離和鑒定，今后將對此進行研究.