鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的抗真菌作用研究進(jìn)展

廖 勇，敖俊紅，楊蓉婭

隨著免疫缺陷患者數(shù)量的逐年增加，機(jī)會(huì)性真菌感染在臨床中也越來越常見，最常見的病原真菌包括：念珠菌屬、隱球菌屬和曲霉菌屬[1]。目前針對(duì)上述病原真菌引起的深部真菌病可選擇的抗真菌藥物種類較少，且均存在不同程度的不良反應(yīng)；同時(shí)，這些藥物長(zhǎng)期臨床應(yīng)用可能出現(xiàn)誘導(dǎo)耐藥現(xiàn)象[2]。所以，臨床需要進(jìn)一步研發(fā)新的抗真菌藥物或拓展新的抗真菌治療策略，從而增加治療選擇，降低藥物不良反應(yīng)，并減少原有抗真菌藥的獲得性耐藥[3]。因此，針對(duì)新的靶點(diǎn)探尋新的抗真菌治療策略具有重要的臨床意義[4]。

1 鈣調(diào)磷酸酶與病原真菌

鈣調(diào)磷酸酶（calcinurin）是受Ca2+和鈣調(diào)蛋白（calcineurin，CaM）調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶是多種病原真菌調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)蛋白，Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)途徑調(diào)節(jié)酵母菌和絲狀真菌多種重要的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答反應(yīng)[6]。白念珠菌的鈣調(diào)磷酸酶是由催化亞基（CnA）和調(diào)節(jié)亞基（CnB）組成的異源二聚體[5]。在環(huán)境壓力作用下，Ca2+通過細(xì)胞膜上的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或鈣通道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并結(jié)合CaM；隨著胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的增加，其激活細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶；鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子（Crz1），Crz1 再快速進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)；從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶在細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)轉(zhuǎn)換、陽離子穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[6]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑通過與該信號(hào)通路相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶活性[8,9]。目前臨床常用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑包括：環(huán)孢素、他克莫司和匹美莫司；系統(tǒng)應(yīng)用主要用于器官移植術(shù)后抗排異治療，局部外用主要用于特應(yīng)性皮炎的治療。如環(huán)孢素與親環(huán)蛋白A 結(jié)合后，抑制CaM 與鈣調(diào)磷酸酶的作用，從而阻斷該信號(hào)通路[10,11]。

2 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的抗真菌作用

常用抗真菌藥多數(shù)靶向病原真菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，唑類抗真菌藥抑制真菌麥角固醇的生物合成通路，通過影響真菌細(xì)胞膜的完整性引起細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；棘白菌素類抗真菌藥通過非競(jìng)爭(zhēng)性抑制真菌β-葡聚糖合成，從而影響真菌細(xì)胞壁完整性而引起細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；最終，藥物通過上述作用方式達(dá)到抑菌或殺菌作用[12]。鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)的信號(hào)通路也被證明通過調(diào)節(jié)下游的反應(yīng)元件影響麥角固醇、β-葡聚糖和幾丁質(zhì)的生物合成，從而在真菌細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答時(shí)影響細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整性[13-15]。對(duì)釀酒酵母的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路在釀酒酵母對(duì)唑類抗真菌藥物和特比萘芬的敏感性中發(fā)揮重要作用[16]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路與病原真菌對(duì)抗真菌藥的耐藥表型相關(guān)[17]。如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑聯(lián)合常用抗真菌藥被證明可抑制耐藥菌株的生長(zhǎng)[18]。因此，阻斷鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路目前被認(rèn)為是一種新的針對(duì)深部真菌病的抗真菌策略，既可以提高現(xiàn)有抗真菌藥的抗真菌效果，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)也可部分阻斷病原真菌出現(xiàn)耐藥[19]?；阝}調(diào)磷酸酶在病原真菌生長(zhǎng)及耐藥中的重要作用，近年來越來越多的研究也關(guān)注其作為抗真菌靶點(diǎn)的潛在臨床價(jià)值[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路可調(diào)節(jié)念珠菌屬真菌對(duì)抗真菌藥的敏感性[19]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑與唑類抗真菌藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可將唑類抗真菌藥對(duì)白念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌的抑菌作用轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒕饔肹21,22]。白念珠菌和都柏林念珠菌的鈣調(diào)磷酸酶/Crz1基因突變株均顯示出對(duì)唑類抗真菌藥和棘白菌素類抗真菌藥的敏感性增加[23-25]。但另一方面，魯希特念珠菌只有鈣調(diào)磷酸酶基因突變株對(duì)唑類抗真菌藥敏感性增加，其Crz1基因突變株對(duì)唑類抗真菌藥敏感性下降；上述結(jié)果提示魯希特念珠菌存在非鈣調(diào)磷酸酶依賴的耐藥途徑[26]；同時(shí)也說明不同種屬病原真菌的耐藥機(jī)制有所不同。體外藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)，環(huán)孢素（鈣調(diào)磷酸酶抑制劑）聯(lián)合氟康唑?qū)τ谶蝾惸退幇啄钪榫哂袇f(xié)同作用[27]。他克莫司（FK506，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑）與卡泊芬凈聯(lián)合對(duì)棘白菌素耐藥的都柏林念珠菌或魯希特念珠菌具有協(xié)同作用[23]。FK506 聯(lián)合唑類抗真菌藥對(duì)唑類耐藥念珠菌臨床株也具有一定程度的協(xié)同作用[28]，說明聯(lián)合用藥對(duì)耐藥念珠菌感染治療具有潛在臨床價(jià)值。此外，針對(duì)麥角固醇合成通路其他靶點(diǎn)的抗真菌藥，如特比萘芬，也顯示出與環(huán)孢素的協(xié)同抗念珠菌作用[22]。對(duì)小鼠念珠菌性心內(nèi)膜炎的研究證明，接受氟康唑聯(lián)合環(huán)孢素治療小鼠的心內(nèi)膜原發(fā)性損害和腎臟播散性繼發(fā)性損害的改善優(yōu)于接受氟康唑、兩性霉素B或環(huán)孢素單藥治療方案的小鼠[29]。

對(duì)新生隱球菌的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素和FK506 均可抑制其在37℃下的生長(zhǎng)[30]。盡管FK506 與氟康唑聯(lián)合顯示出協(xié)同抑制新生隱球菌作用，但該表型與鈣調(diào)磷酸酶通路無關(guān)，提示FK506 可能具有其他抗新生隱球菌的藥物靶點(diǎn)[31]。與新生隱球菌不同，研究發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)磷酸酶在格特隱球菌的氟康唑耐藥中發(fā)揮重要作用，提示鈣調(diào)磷酸酶在不同菌種間的耐藥表型存在差異[32]。一項(xiàng)對(duì)器官移植后伴發(fā)新生隱球菌感染患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在接受抗真菌治療方案一致，使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或FK506）作為抗排異藥物的患者預(yù)后明顯優(yōu)于接受其他類型抗排異藥物（硫唑嘌呤或酚酸酯）患者的預(yù)后[33]。

研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)HSP90-鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路的抑制劑對(duì)多種絲狀真菌的生長(zhǎng)也具有抑制作用[34]。對(duì)煙曲霉的研究發(fā)現(xiàn)，CrzA（Crz1同源基因）在其β-葡聚糖生物合成中發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用[35]。體外藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或FK506）對(duì)煙曲霉的生長(zhǎng)具有抑制活性[36]；同時(shí)，也可增強(qiáng)伊曲康唑或棘白菌素類抗真菌藥的抗煙曲霉活性[37]。此外，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可將原本卡泊芬凈對(duì)煙曲霉的抑菌作用轉(zhuǎn)變?yōu)闅⒕饔肹38]。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑被證明對(duì)煙曲霉不同的唑類或棘白菌素類耐藥臨床分離株均具有抗菌活性[39]。對(duì)可引起毛霉病的球囊菌綱病原真菌的體外藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可顯著提高該類病原菌對(duì)卡泊芬凈的體外敏感性，且部分組合顯示出協(xié)同作用[40]。

通過梯度濃度誘導(dǎo)耐藥的模型研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素）可明顯降低氟康唑或伏立康唑誘導(dǎo)白念珠菌臨床株對(duì)其產(chǎn)生的耐藥表型，但鈣調(diào)磷酸酶抑制劑對(duì)于黃曲霉的唑類藥物（氟康唑或伏立康唑）誘導(dǎo)耐藥表型無影響；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑對(duì)于白念珠菌的卡泊芬凈誘導(dǎo)耐藥無影響[19]。另一項(xiàng)關(guān)于氟康唑聯(lián)合鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（FK506）對(duì)白念珠菌耐藥表型的研究發(fā)現(xiàn)，通過體外誘導(dǎo)獲得的氟康唑耐藥表型是依賴HSP90-鈣調(diào)磷酸酶通路，而從長(zhǎng)期接受氟康唑治療患者（2 年）分離到的氟康唑耐藥株其耐藥表型是非HSP90-鈣調(diào)磷酸酶通路依賴的。同時(shí)，體外聯(lián)合用藥時(shí)出現(xiàn)的氟康唑耐藥同樣與HSP90-鈣調(diào)磷酸酶通路相關(guān)，說明復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境以及長(zhǎng)時(shí)間的氟康唑暴露與可控條件下體外誘導(dǎo)獲得的耐藥方式之間存在一定差異，從而影響白念珠菌對(duì)選擇性環(huán)境壓力的應(yīng)答反應(yīng)[41]。上述研究提示，早期應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可能阻斷部分病原真菌因?yàn)槭褂每拐婢幩霈F(xiàn)的臨床耐藥問題。

3 展望

由于目前抗真菌藥物種類較少，且不斷出現(xiàn)的臨床耐藥現(xiàn)象，而聯(lián)合使用針對(duì)鈣調(diào)磷酸酶通路靶點(diǎn)的抗真菌治療策略可能獲得較好的臨床預(yù)后[17,19,20]，特別是針對(duì)臨床常見的、白念珠菌氟康唑耐藥具有潛在臨床價(jià)值[42]。目前臨床使用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（環(huán)孢素或FK506）由于其免疫抑制作用，不可能作為抗真菌藥物被臨床使用；但研發(fā)和應(yīng)用特異性靶向真菌鈣調(diào)磷酸酶通路，而與宿主無交叉反應(yīng)（對(duì)宿主免疫功能無影響）的環(huán)孢素或FK506 衍生物具有一定的臨床意義，從而避免在抗真菌治療過程中出現(xiàn)對(duì)宿主的免疫抑制[20]。新的藥物研發(fā)進(jìn)展已經(jīng)可以設(shè)計(jì)并合成無免疫抑制作用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供選擇。已經(jīng)有兩種無免疫抑制作用的環(huán)孢素衍生物被證實(shí)具有抑制新生隱球菌鈣調(diào)磷酸酶的活性，抑制劑L-685 和L-818 對(duì)宿主無明顯免疫抑制作用，但可有效抑制新生隱球菌及其氟康唑耐藥株的生長(zhǎng)，且其抑制效果與FK506 類似[43]。

如上所述，還需要進(jìn)一步更為深入的機(jī)制研究，特別是鈣調(diào)磷酸酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中抗真菌有效靶點(diǎn)的研究，以及設(shè)計(jì)和檢測(cè)無免疫抑制作用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，從而安全應(yīng)用于臨床抗真菌治療，提高深部真菌病患者的臨床預(yù)后，并降低常用抗真菌藥的臨床耐藥。