利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)在結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展

梁 愈，吳桂輝，黃 濤，章曉紅，陳 紅，Δ

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心，四川 成都 610061；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610072)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是感染結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)而引起的一種慢性傳染病，WHO最新工作報(bào)告顯示[1]，2016年全世界約1040萬(wàn)人患病，170萬(wàn)人死亡，60萬(wàn)新病例對(duì)利福平(rifampicin，RIF)耐藥，TB依然是全球公共衛(wèi)生的重大威脅。目前TB診斷方法主要包括涂片法、結(jié)核培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)(DST)等，涂片法簡(jiǎn)便、快速，但靈敏度低；結(jié)核培養(yǎng)靈敏度和特異度較高，且可對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行DST，但耗時(shí)長(zhǎng)，易延誤診治?；趥鹘y(tǒng)方法的局限性，新的診斷技術(shù)Xpert MTB/RIF檢測(cè)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)的以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的全自動(dòng)分子診斷方法，全程只需約2小時(shí)，即可檢測(cè)MTB和RIF耐藥，被廣泛認(rèn)為是TB診斷的突破口。下面將對(duì)該技術(shù)在肺結(jié)核(PTB)、肺外結(jié)核(EPTB)、兒童TB、HIV/MTB雙重感染及耐多藥結(jié)核(MDR-TB)中的應(yīng)用做一綜述。

1 Xpert MTB/RIF在PTB患者中的應(yīng)用

TB可累及全身多個(gè)臟器，以PTB最為常見(jiàn)，占各器官TB總數(shù)的80%～90%，是最主要的TB類(lèi)型。Xpert MTB/RIF作為PTB的一線(xiàn)快速診斷試驗(yàn)，其診斷價(jià)值得到了國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可，Steingart等[2]報(bào)道，Xpert MTB/RIF作為替代涂片的初步測(cè)試，匯總靈敏度為89%，匯總特異度為99%；作為涂陰后的附加測(cè)試，匯總靈敏度為67%，匯總特異度為99%；對(duì)于涂陽(yáng)、培陽(yáng)的標(biāo)本，匯總靈敏度為98%。最新meta分析中報(bào)道[3]，與結(jié)核培養(yǎng)相比，Xpert MTB/RIF靈敏度為87%，特異度為97%，在涂陽(yáng)中，靈敏度為99%；涂陰中靈敏度為70%，與Steingart等[2]報(bào)道相近。Xpert檢測(cè)在培養(yǎng)陽(yáng)性中靈敏度高，但仍不到100%，因?yàn)榕囵B(yǎng)陽(yáng)性?xún)H代表分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，而Xpert MTB/RIF能檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，能有效的鑒定MTB和NTM。不管是國(guó)外還是國(guó)內(nèi)研究中都報(bào)道了Xpert MTB/RIF在PTB診斷中的高敏感性和特異性，證實(shí)了其診斷價(jià)值，并推薦在結(jié)核病的初步檢測(cè)中應(yīng)用。

1.1痰標(biāo)本的XpertMTB/RIF檢測(cè)痰液為最常使用的呼吸道標(biāo)本，其Xpert MTB/RIF試驗(yàn)在世界范圍內(nèi)各研究機(jī)構(gòu)開(kāi)展較為廣泛，Chikaonda等[4]報(bào)道的痰標(biāo)本行Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度為93.8%，特異度為97.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為97.8%和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)92.6%。一項(xiàng)大樣本研究顯示[5]，Xpert MTB/RIF檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性PTB的總體靈敏度為95.7%，特異度為99.3%；涂陽(yáng)、培陽(yáng)組中靈敏度為99.2%；在檢測(cè)不同的痰液標(biāo)本時(shí)，該試驗(yàn)的靈敏度和特異度有差異，使用咳出痰作為檢測(cè)標(biāo)本時(shí)，其靈敏度和特異度均較誘導(dǎo)痰高。另有報(bào)道Xpert MTB/RIF與涂片法和培養(yǎng)法對(duì)PTB檢測(cè)的一致性良好，Kappa值分別為0.783和0.818[6]。目前痰的Xpert檢測(cè)的報(bào)道較其他標(biāo)本多，其高靈敏度和特異度得到有力證實(shí)，同時(shí)其與痰結(jié)核培養(yǎng)的一致性高，可推薦作為臨床使用。

1.2支氣管肺泡灌洗液(BALF)標(biāo)本的XpertMTB/RIF檢測(cè)有學(xué)者認(rèn)為在我國(guó)BALF為更可靠的呼吸道標(biāo)本，BALF的Xpert MTB/RIF試驗(yàn)可以在檢測(cè)早期PTB時(shí)提供準(zhǔn)確結(jié)果，尤其在反復(fù)痰涂片陰性和自主排痰困難、無(wú)痰或痰少患者中更有應(yīng)用價(jià)值。Gowda等[7]的最新研究中證實(shí)，在痰涂陰性和痰少患者中，BALF行Xpert檢測(cè)在PTB的診斷中具有較好的靈敏度，同時(shí)在培養(yǎng)陰性中亦有較好的診斷價(jià)值。在我國(guó)有關(guān)BALF的Xpert MTB/RIF試驗(yàn)準(zhǔn)確性的報(bào)道相對(duì)較少，一回顧性研究中提到[8]，以結(jié)核培養(yǎng)作為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF的靈敏度為84.5%，特異度98.9%；以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的靈敏度和特異度分別為72.9%和98.7%，顯著高于涂片法。另一雙中心前瞻性研究也肯定了BALF的Xpert檢測(cè)在中國(guó)成人PTB診斷中的價(jià)值，研究中報(bào)道，以結(jié)核培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測(cè)PTB的靈敏度為83.1%，特異度為84.1%，靈敏度與Lu等[8]研究相近，特異度有差異[9]。韓丹等[10]通過(guò)比較BALF抗酸涂片、結(jié)核培養(yǎng)和 Xpert試驗(yàn)三種檢測(cè)方法，其曲線(xiàn)下面積(AUC)分別為 0.551、0.674、0.810，顯示Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷效能最大；同時(shí)對(duì)Xpert MTB/RIF和結(jié)核培養(yǎng)進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa值為0.55，顯示兩種檢測(cè)方法一致性較好。

1.3非呼吸道標(biāo)本的XpertMTB/RIF檢測(cè)研究證實(shí)，多種非呼吸道標(biāo)本的Xpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)TB的診斷有較好準(zhǔn)確性。Sulis等[11]的研究中提到，在非呼吸道樣本中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為78.3%、91.5%、81.8%和89.6%。Kokuto等[12]關(guān)于糞便Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷PTB的報(bào)道中，在痰涂片陽(yáng)性(1+至3+)患者中，糞便Xpert MTB/RIF的靈敏度為100%，痰涂片弱陽(yáng)性(±)患者中靈敏度為是81.0%，痰涂片陰性(-)患者中的靈敏度是50.0%；非TB組的所有糞便樣本Xpert MTB/RIF檢測(cè)均為陰性，診斷特異度為100%。在涂陰PTB的研究中，胃灌洗液(GLA)行MGIT檢測(cè)和Xpert的靈敏度分別為12.1%和48.6%，與國(guó)內(nèi)的研究一致，均肯定了GLA標(biāo)本的高陽(yáng)性率[13，27]。

2 Xpert MTB/RIF在EPTB患者中的應(yīng)用

EPTB是指結(jié)核病變發(fā)生在肺以外的器官和部位，約占所有TB的15%，有meta分析中提到，XpertMTB/RIF在診斷EPTB的靈敏度和特異度分別為77%和97%[14]。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道[3]，以結(jié)核培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert用于診斷EPTB的靈敏度為80%，特異度為97%，AUC為97%。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，以培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert診斷EPTB的靈敏度為0.763，特異度為0.987[15]，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相近。Xpert MTB/RIF在EPTB的診斷中靈敏度及特異度較診斷PTB低，可能因?yàn)閄pert MTB/RIF檢測(cè)的準(zhǔn)確性與標(biāo)本類(lèi)型及標(biāo)本內(nèi)MTB的濃度有關(guān)，而EPTB的標(biāo)本取材困難、標(biāo)本異質(zhì)性大、含菌量少等，所以導(dǎo)致該檢測(cè)在EPTB的診斷效能低于在PTB中的診斷效能。

2.1結(jié)核性胸膜炎(TP) TP為最常見(jiàn)的EPTB之一，目前TP的診斷主要依賴(lài)在胸腔積液或胸膜中通過(guò)培養(yǎng)檢測(cè)MTB，或通過(guò)組織病理學(xué)檢查來(lái)證明胸膜中的干酪性肉芽腫。據(jù)研究報(bào)道，以結(jié)核培養(yǎng)作為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF的總體靈敏度為59%和特異度為92%，在不同的標(biāo)本中其靈敏度存在差異，液體標(biāo)本的靈敏度為51%，其中胸水為僅為47%[16]。國(guó)外Meta分析中提到[14]，胸水Xpert檢測(cè)的匯總靈敏度較低(37%)；國(guó)內(nèi)最新的meta分析中也報(bào)道，胸水Xpert檢測(cè)的匯總靈敏度和特異度分別為30%和99%[17]。綜合目前國(guó)內(nèi)外研究，胸腔積液Xpert MTB/RIF試驗(yàn)靈敏度較低，作為T(mén)P的篩選測(cè)試價(jià)值有限。胸膜活檢為更可靠的診斷TP的方法，有報(bào)道涂片陰性的TP患者胸膜活檢樣本行Xpert MTB/RIF試驗(yàn)的靈敏度和特異度分別為85.5%、97.2%[18]，均較胸腔積液樣本高，可彌補(bǔ)液體樣本的不足，更能準(zhǔn)確診斷TP。

2.2結(jié)核性腦膜炎(TBM) TBM是最嚴(yán)重的TB類(lèi)型，診斷困難，易延誤診治。以臨床診斷TBM為標(biāo)準(zhǔn)，腦脊液(CSF)的Xpert檢測(cè)的靈敏度為59.3%，特異度為99.5%，而CSF涂片和培養(yǎng)的靈敏度分別為78.6% 和66.5%，均較Xpert法高[19]。有報(bào)道離心CSF樣本Xpert檢測(cè)的靈敏度顯著高于未離心樣本，與培養(yǎng)的靈敏度相近，離心CSF優(yōu)化了Xpert試驗(yàn)在TBM檢測(cè)中的性能[20]。除外常用的CSF檢查，組織病檢亦是診斷TBM的途徑，對(duì)于組織病理學(xué)確診的TBM，Xpert檢測(cè)的靈敏度為100%，特異度為87%，對(duì)于組織病理學(xué)高度懷疑TBM的病例，其靈敏度為是87%[21]。Xpert檢測(cè)對(duì)于TBM的診斷能力有限，應(yīng)綜合臨床各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估及診斷，避免延誤診治。

2.3其他EPTB最新meta分析中提到[22]，Xpert MTB/RIF檢測(cè)在肌肉骨骼TB的診斷中，匯總靈敏度和特異度分別為81.0%和83.0%，AUC超過(guò)0.9，表明Xpert用于檢測(cè)肌肉骨骼TB總體診斷準(zhǔn)確度相對(duì)較高。在脊柱TB的應(yīng)用中，抗酸染色、BACTEC MGIT960液體培養(yǎng)及Xpert檢測(cè)的靈敏度分別為25.92%、48.15%、77.78%，Xpert的靈敏度顯著高于傳統(tǒng)方法[23]。Xpert檢測(cè)在結(jié)核性腹膜炎中應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少，Edwards等[24]的報(bào)道中肯定了Xpert在結(jié)核性腹膜炎診斷中的價(jià)值，推薦在腹膜透析患者中早期篩查，避免延誤診斷。

3 Xpert MTB/RIF在兒童TB中的應(yīng)用

Xpert MTB/RIF檢測(cè)在成人的應(yīng)用價(jià)值得到了較多的肯定，因兒童TB的特殊性(不典型的臨床癥狀、排痰取痰困難、標(biāo)本含菌量少、不配合肺外標(biāo)本獲取等)，其在兒童PTB和EPTB方面的應(yīng)用受限。痰液Xpert MTB/RIF檢測(cè)診斷兒童PTB的匯總靈敏度為62%，匯總特異度為98%[25]。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道使用BALF和GLA這兩種標(biāo)本分別行涂片、培養(yǎng)和Xpert檢測(cè)，均顯示Xpert的靈敏度顯著高于另外兩種方法[26]。Lu等[27]的報(bào)道中提到，收集確診TB的兒童的痰液、GLA、BALF和CSF等樣本，Xpert的檢出率顯著高于固體培養(yǎng)，且不同樣本類(lèi)型的Xpert陽(yáng)性率顯著不同，GLA的陽(yáng)性率最高。在合并HIV感染的兒童TB中，痰/胃抽吸物Xpert的靈敏度為60%，特異性為98%，糞便Xpert的靈敏度為63%，特異度為99%[28]。由于兒童自主排痰困難，且痰標(biāo)本容易污染，合格率低，而GLA、BALF等非痰液標(biāo)本的陽(yáng)性率相對(duì)較高，因此臨床上可通過(guò)非痰標(biāo)本的Xpert檢測(cè)提高兒童TB的檢出率。

4 Xpert MTB/RIF在HIV/MTB雙重感染患者中的應(yīng)用

TB是HIV患者最易感染的疾病之一，也是最主要的致死原因，成人HIV患者中約16.9%合并MTB感染[29]，據(jù)WHO報(bào)告，2016年，艾滋病病毒陽(yáng)性者中有37.4萬(wàn)人死于PTB，全球TB中約10%為艾滋病病毒感染者[1]。因此，在HIV/MTB雙重感染的患者中，早期的明確MTB診斷，及時(shí)的抗MTB治療，有助于降低HIV患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。Steingart等[2]報(bào)道，對(duì)于HIV感染者，Xpert MTB/ RIF匯總靈敏度為79%，對(duì)于沒(méi)有感染艾滋病毒的患者，匯總靈敏度為86%。另外，Xpert的靈敏度與患者免疫缺陷狀態(tài)相關(guān)，有報(bào)道中提到，免疫缺陷嚴(yán)重組(CD4+<100 cells/mm3)中Xpert的靈敏度為82.9%，免疫缺陷輕癥組(CD4+>200 cells/mm3)中其靈敏度為46.7%，嚴(yán)重組顯著高于輕癥組[29]。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，在HIV陽(yáng)性的患者中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度為81%，特異度為98%[3]，特異度均較高，靈敏度與國(guó)外研究有差異，可在國(guó)內(nèi)進(jìn)一步展開(kāi)該研究，更準(zhǔn)確了解我國(guó)HIV/TB雙重感染現(xiàn)狀及Xpert檢測(cè)在該類(lèi)患者中的診斷價(jià)值。由于HIV/TB 患者的痰標(biāo)本常不易獲取，臨床中常使用尿液樣本行Xpert檢測(cè)，有研究比較了痰樣本、尿樣本、痰和尿樣本聯(lián)合使用行Xpert檢測(cè)，三組的靈敏度分別為28.1%、64.0%和77.7%[30]，可見(jiàn)在HIV/TB雙重感染患者中，采用多種標(biāo)本聯(lián)合行Xpert檢測(cè)可有助于提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，從而準(zhǔn)確檢出結(jié)核。

5 Xpert MTB/RIF在MDR-TB患者中的應(yīng)用

MDR-TB指致病MTB至少同時(shí)耐異煙肼 (INH) 和RIF。據(jù)WHO報(bào)告，2016年約49萬(wàn)患有MDR-TB，約4.1%的新發(fā)病例和19%的接受過(guò)抗結(jié)核治療的病例患有MDR-TB[1]。早期檢測(cè)出機(jī)體對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥情況，有針對(duì)性的選擇抗結(jié)核藥物，避免無(wú)效的抗結(jié)核治療。目前檢測(cè)MDR-TB常用的DST為BACTEC MGIT960，有相關(guān)文獻(xiàn)均提到，在檢測(cè)MTB及耐藥性方面，BACTEC MGIT960法與傳統(tǒng)的羅式培養(yǎng)藥敏高度一致，用時(shí)需1周至半月左右，可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)及藥敏檢測(cè)[31]，而Xpert MTB/RIF檢測(cè)與BACTEC MGIT960法在檢測(cè)RIF耐藥方面一致性較高，用時(shí)僅需2小時(shí)。Xpert檢測(cè)在MDR-TB診斷的總體靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為98.6%、100%、100%和93.8%[32]，因其高靈敏度使得其可與常規(guī)DST媲美。但實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)Xpert與BACTEC MGIT960法在檢測(cè)RIF耐藥性方面仍存在一定差異，因Xpert對(duì)rpo-B基因啞變異的菌株可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，而啞變異的基因并不會(huì)改變其相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此可能造成Xpert法與常規(guī)DST結(jié)果不一致，可能與MTB存活狀態(tài)、標(biāo)本含菌量、患者的用藥史等有關(guān)。最新的meta分析報(bào)道，Xpert在檢測(cè)耐藥性方面，新發(fā)耐RIF的病例中有33.3%表現(xiàn)出對(duì)INH敏感，而之前已接受抗結(jié)核治療的耐RIF病例中有14.8%對(duì)INH敏感[33]，可見(jiàn)在檢測(cè)RIF耐藥的基礎(chǔ)上，Xpert檢測(cè)并不能完全準(zhǔn)確反映INH耐藥情況。因此，臨床上對(duì)于Xpert MTB/RIF檢測(cè)出RIF耐藥的病例，可再行常規(guī)的DST進(jìn)一步明確?？傮w來(lái)說(shuō)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)靈敏度高，用時(shí)少，在MDR-TB的診斷上具有足夠的優(yōu)勢(shì)，可指導(dǎo)臨床快速識(shí)別MDR-TB，從而盡早選擇更合理的抗結(jié)核治療方案，提高M(jìn)DR-TB患者的治療療效，降低死亡率。

6 總結(jié)與展望

Xpert MTB / RIF是一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)MTB及RIF耐藥的方法，尤其在PTB、HIV/MTB及MDR-TB患者中的診斷價(jià)值較高，但在EPTB及兒童TB應(yīng)用中有其局限性，可通過(guò)不同標(biāo)本的聯(lián)合送檢提高其檢測(cè)的準(zhǔn)確度?？傊摲椒煽焖賻椭R床醫(yī)生做出臨床決策，應(yīng)用價(jià)值較高，值得臨床推廣。