誘發(fā)支氣管哮喘動物模型方法及評價

張丹參 張 楠

河北科技大學，石家莊，050018，中國

哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，具有可逆性氣道阻塞，黏液分泌增加，氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑的特征［1］。在哮喘氣道中，炎癥細胞包括肥大細胞，樹突細胞，淋巴細胞和嗜酸性粒細胞被激活［2］。大多數(shù)哮喘患者都是特應(yīng)性疾病，

氣道炎癥過敏，從氣管延伸到外周氣道［3-4］。過敏性炎癥由輔助2（T helper cell 2，Th2）淋巴細胞驅(qū)動，分泌白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4），IL-5 和IL-13，被稱為2 型（T2）哮喘，而一些哮喘患者則沒有這種炎癥模式，這被稱為非T2 哮喘［1，5］。理想的哮喘動物模型至少應(yīng)具備氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性兩大特征，因而合適的哮喘動物模型對哮喘病因及發(fā)病機制研究中有十分重要的意義［1］。

本文通過對哮喘動物模型中動物種類、體質(zhì)量、建模方法等做了相對全面的介紹，特別是對相關(guān)模型的評價，為今后研究中選擇合適的動物模型提供方便，為研究哮喘發(fā)病機制及其治療途徑、治療藥物提供新思路。

1 動物的選擇

建立哮喘動物模型，是利用所選品系的物種更好地模仿哮喘的過程與特征，與人類完全相同的動物自發(fā)性哮喘模型目前還未發(fā)現(xiàn)，往往需要人工加以復制，盡量做到與人類哮喘相似［6-7］。綿羊及靈長類雖可模擬人類對藥物的反應(yīng)，但價格昂貴，可能發(fā)生微生物的亞臨床感染，不予選擇。目前制作哮喘模型多選用豚鼠、大鼠、小鼠，他們具有易于操作和相對成本低的優(yōu)點。

1.1 小鼠

小鼠是支氣管哮喘研究最常用的動物模型［1，8］，小鼠的基因組背景純凈，品系豐富，可復制出哮喘經(jīng)典的氣道高反應(yīng)、氣道慢性炎癥、黏液增多等癥狀［9］。小鼠模型的缺點是缺乏慢性病敏感后對過敏原的反應(yīng)，造模需要多次致敏和激發(fā)，不同于人類哮喘的肺部分布。到目前為止所描述的大多數(shù)模型更適合于研究急性炎癥，它們不能代表慢性炎癥，大多數(shù)用于研究這種疾病的動物模型都是基于Th2 驅(qū)動的疾病表型，而50%的哮喘患者患有此類疾病特應(yīng)性氣道疾病沒有Th2 介導的免疫反應(yīng)或反應(yīng)非常復雜的特征［10］。

1.2 大鼠［11］

大鼠也是常見的用于過敏性氣道模型的動物，來源廣，易繁殖和飼養(yǎng)，它們與小鼠一樣相對便宜，生物學試劑種類多且易獲得，對抗原的反應(yīng)性較為一致。麻醉條件下大鼠體積大，穩(wěn)定性高，這有利于測量實驗所需的各項指標。

1.3 豚鼠

豚鼠易被致敏，是最早選用的哮喘動物模型［12］。在評估抗哮喘藥物時，豚鼠是用做過敏性支氣管哮喘模型的首選，因為氣道解剖和對炎癥介質(zhì)的反應(yīng)與人類相似。此外，該模型的強大之處在于抗原攻擊時的直接過敏性支氣管收縮。在某些條件下，可以測量晚期哮喘反應(yīng)并且在體外和體內(nèi)觀察到氣道高反應(yīng)性［13-14］。使用的主要缺點是豚鼠缺乏特異性探針和試劑研究過敏結(jié)果，豚鼠的妊娠時間較長，需要60～75 天，另外反復接觸過敏原易產(chǎn)生耐受性。

1.4 兔子

當肺是過敏的靶器官時，兔子就像人類一樣，它也產(chǎn)生免疫球蛋白（immunoglobulin E，IgE）作為原發(fā)性過敏性抗體［15］。Ali 等［16］通過卵清蛋白誘導新西蘭白兔過敏，兔子存在喘息、打噴嚏、胸悶、呼吸短促、總白細胞水平和中性粒細胞增多的臨床癥狀，證實致敏作用。但是兔子較鼠難以得到，而且成本較高。

1.5 犬

雜交犬在人類哮喘中表現(xiàn)出非特異性支氣管高反應(yīng)性［17］。但有研究表示犬不能代表真正的哮喘動物模型，而是提供一系列的氣道反應(yīng)［18］。另外犬的氣道較大（幾乎沒有支氣管收縮）［19］，特異性試劑不完備，不易獲得，實驗過程中耗費大量人力。

1.6 貓

貓可以自發(fā)地發(fā)展為特異性哮喘，目前可用的過敏性貓科動物模型在肺功能、支氣管反應(yīng)性、氣道炎癥和肺形態(tài)（重塑）方面具有很好的特征［20］。狗和貓的過敏性肺病可以更準確地模擬人類狀況，但可用于表征機制的工具較少［21］。

1.7 其它

缺乏側(cè)支氣道（即豬和牛）的其他物種對氣道阻塞的功能性后果最敏感，因此適合研究任何阻塞性肺病。體質(zhì)量與人類（豬，綿羊，小牛）相當?shù)膭游锾峁┝耸褂迷谧灾骱粑陂g適用于兒童或成人的相同原理和技術(shù)來評估肺功能的可能性（產(chǎn)生直接可比范圍內(nèi)的肺功能數(shù)據(jù)）。盡管已知的缺點是昂貴且耗時，免疫學或分子工具的可用性有限，但是大型動物模型提供了進行長期功能研究的巨大潛力，允許同時進行功能性，炎癥性和形態(tài)學變化的觀察與測定［21］。

2 誘發(fā)哮喘動物模型的方法

過敏性哮喘的模型制備有主動致敏和被動致敏兩種方法，前者是給動物投抗原物質(zhì)以致敏，再給予相同物質(zhì)以誘發(fā)哮喘；后者是從致敏的豚鼠體內(nèi)采集血液，分離血清并將其注入未致敏的豚鼠體內(nèi)使其致敏，然后再給予用于致敏的抗原物質(zhì)以誘發(fā)哮喘發(fā)作。作為抗原最常用的是卵白蛋白、血小板激活因子、蛔蟲、天花粉、內(nèi)毒素、結(jié)晶細菌性α-淀粉酶等。

2.1 卵白蛋白激發(fā)動物模型

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）來源于蛋清，不會在人體內(nèi)引起氣道炎癥，價格便宜，有很強的免疫原性［22］，因此被認為是一種良好的過敏原。

2.1.1 OVA 激發(fā)豚鼠哮喘動物模型

方法概述：將過敏原卵白蛋白腹腔或多點皮下注射［23］，其可溶性抗原成分刺激機體產(chǎn)生特異性IgE，使機體處于致敏狀態(tài)。當豚鼠再次接觸到此抗原時，由IgE 介導發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，使細胞脫顆粒，釋放出活性化學物質(zhì)如組胺、嗜酸性粒細胞趨化因子等，作用于支氣管引起氣道高反應(yīng)導致哮喘。OVA 常與佐劑氫氧化鋁聯(lián)合使用，氫氧化鋁可以增強免疫系統(tǒng)的抗原特異性Th2 免疫應(yīng)答［24-25］。

方法評價：卵白蛋白激發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作是目前國內(nèi)外常用的方法［22］，其操作簡單且具有很強的可復制性。另外，本模型不需要鎮(zhèn)靜劑，但通常需要加入佐劑。

豚鼠是最好的顯示氣道反應(yīng)性的特征動物，其哮喘發(fā)作表現(xiàn)與人的哮喘表現(xiàn)相似，可出現(xiàn)氣喘，咳嗽，煩躁，口唇和四肢紫紺，呼吸困難，呼吸頻率明顯加快，呼吸加深。病理檢查可發(fā)現(xiàn)毛細血管擴張，嗜酸性粒細胞侵潤，腺體分泌活動亢進，同時伴有支氣管黏膜下水腫。本模型主要用于哮喘發(fā)病機制的研究和治療觀察。

使用雄性豚鼠，體質(zhì)量200～300 g，腹腔注射10%卵白蛋白生理鹽水溶液1 mL 使豚鼠處于致敏狀態(tài)，2周后以1%卵白蛋白生理鹽水溶液霧化吸入至豚鼠出現(xiàn)哮喘癥狀，每次數(shù)秒至數(shù)分鐘不等，每天1 次，連續(xù)5 天［26］。亦可選用200～300 g 的豚鼠，雌雄各半，常規(guī)飼養(yǎng)5～7 天無異常后，予10%卵白蛋白生理鹽水溶液200 mg·kg-1腹腔注射，于第15 天，予5%卵白蛋白生理鹽水溶液霧化吸入誘導哮喘發(fā)作［27］。Hutson 等［28］，首先給予豚鼠霧化吸入1% OVA 生理鹽水溶液，每周兩次，每次3 分鐘，三周后，2% OVA 生理鹽水溶液霧化吸入5 min 激發(fā)。激發(fā)后五分鐘即發(fā)生速發(fā)性哮喘反應(yīng)，激發(fā)后17 h 和74 h 發(fā)生兩次遲發(fā)性哮喘反應(yīng)。另外Rakesh 等［29］將100 μg 卵清蛋白和100 mg 氫氧化鋁溶于1 mL 生理鹽水，在渦旋混合器上劇烈攪拌90分鐘，然后腹膜內(nèi)注射0.5 mL，皮下注射0.5 mL，在淋巴結(jié)附近的5 個不同部位之間平均分配，即頸椎，腋窩，腰椎，頸部和腹股溝，研究證實該方案可致敏。

2.1.2 OVA 激發(fā)小鼠哮喘模型

方法概述：腹腔注射一定量的OVA、氫氧化鋁混合液，并用OVA PBS 溶液霧化激發(fā)哮喘。

方法評價：本模型主要用于哮喘發(fā)病機制以及藥物有效性的研究。行為表現(xiàn)：OVA 致敏哮喘小鼠經(jīng)霧化激發(fā)后明顯出現(xiàn)煩躁不安、活動減少、呼吸困難、大小便失禁等哮喘發(fā)作表現(xiàn)。肺組織病理染色形態(tài)學改變：OVA 致敏激發(fā)哮喘小鼠肺內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，氣道壁增厚、破壞明顯，氣管痙攣，管腔變狹窄，杯狀細胞增生，黏液腺分泌增加，黏液栓形成，彈力纖維增生［30］。小鼠哮喘模型中嗜酸性粒細胞數(shù)增加了12.6倍，嗜堿性粒細胞數(shù)增加了3.5 倍，淋巴細胞數(shù)增加了3.1 倍。

使用6 周齡雌性小鼠，保持在（21±2）℃和（50±5）%相對濕度的受控環(huán)境中，具有12 h 暗/亮循環(huán)。將50 μg OVA 溶于1 mg 100 μL 的氫氧化鋁凝膠佐劑中，充分攪拌，第1，7，14 天腹腔注射入小鼠體內(nèi)致敏。最后一天用濃度為1 mg·mL-1的OVA PBS 溶液超聲霧化器霧化，對照組用PBS 溶液攻擊［31］。亦可選用4周的C57BL/6J 小鼠，雌性，腹腔注射OVA 的PBS溶液（50 μg OVA 溶于含有4 毫克明礬的PBS 溶液中）0.5 mL，間隔七天，連續(xù)致敏兩次，兩周后用1%OVA（wt/vol） PBS 溶液霧化30 min，每日兩次，連續(xù)三天［32］。

2.1.3 OVA 激發(fā)大鼠哮喘動物模型

方法概述：腹腔注射含有OVA，滅活百日咳桿菌疫苗和氫氧化鋁的生理鹽水，或OVA，氫氧化鋁生理鹽水，一定時間后用一定濃度的OVA 霧化致敏。

方法評價：本模型適用于特異性抗原抗體反應(yīng)的研究，有速發(fā)和遲發(fā)雙相反應(yīng)［33］。動物可出現(xiàn)打噴嚏，瘙癢和鼻漏，呼吸急促，嚴重者呼吸減慢或節(jié)律不齊，輕度紫紺，四肢癱軟，行動遲滯或俯伏不動［34］；反應(yīng)遲鈍，站立不穩(wěn)、腹肌痙攣、呼吸急促、精神萎靡、煩躁不安［35］；連續(xù)激發(fā)后大鼠體質(zhì)量減輕，毛色失去光澤［36］。病理組織學檢查可見，鼻甲的漿液性腺管中的黏膜炎癥，血管擴張［37］，細小支氣管壁及其伴行血管周圍有較多炎性細胞浸潤。杯狀細胞增生，平滑肌增厚，管腔狹窄閉鎖，部分肺泡壁融合形成肺氣腫［36］。此種SD 大鼠模型的病理改變符合支氣管哮喘的病情變化，適合做基礎(chǔ)與臨床研究［35］。

選用雄性SD 大鼠，4～6 周齡，體質(zhì)量120～180 g，腹腔注射抗原液1 mL（含卵白蛋白100 mg，滅活百日咳桿菌疫苗5×109個和氫氧化鋁干粉100 mg）致敏。2 周后用超聲霧化器向自制霧化箱內(nèi)噴霧1%卵白蛋白20 min，直至動物出現(xiàn)哮喘反應(yīng)［37］。另外Mustafa 等［38］，選用200～250 g，20～22 周雌性大鼠，隔天腹腔注射1 mL 卵白蛋白生理鹽水（1 mg 卵白蛋白+10 mg 氫氧化鋁溶于1 mL 生理鹽水中），連續(xù)14 天致敏，并且保證在相同時間給藥。

2.2 血小板活性因子（platelet activating factor，PAF）激發(fā)豚鼠哮喘模型

方法概述：血小板活性因子激發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作不需要致敏過程，直接利用其特性而引發(fā)氣道的高反應(yīng)性。

方法評價：PAF 是目前已知的唯一能引起氣道高反應(yīng)性炎癥介質(zhì)，具有許多影響哮喘病理變化的效應(yīng)，如PAF 引起豚鼠支氣管收縮，微血管滲漏，黏液分泌過多，支氣管反應(yīng)性增加，嗜酸性粒細胞募集在豚鼠的氣道中［39-40］。另外PAF 通過嗜酸性粒細胞的活化趨化、脫顆粒、釋放嗜酸性粒細胞蛋白X（eosinophil protein x，EPX）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）和堿性蛋白等細胞毒性物質(zhì)引起氣道上皮細胞損傷和脫落。同時，激活的嗜酸性粒細胞本身又合成并釋放PAF，使這一過程加劇，最終引起氣道高反應(yīng)［41］。本模型主要用于哮喘病因?qū)W和發(fā)病機制的研究。

選用300～500 g 成年雄性豚鼠，在激發(fā)實驗時，用含0.25%小牛血清白蛋白的生理鹽水，將PAF 稀釋成500 μg·mL-1，按1 500 μg·kg-1體質(zhì)量的劑量霧化吸入，可引起豚鼠哮喘發(fā)作。此外，選用Hartley 豚鼠，雄性，200 g，按100 μg·kg-1的劑量霧化吸入PAF 生理鹽水，每周2 次，連續(xù)三周，可引起豚鼠哮喘［42］。

2.3 豬蛔蟲抗原致犬過敏性哮喘模型

方法概述：①豬蛔蟲抗原制備：將收集到的豬蛔蟲用生理鹽水清洗數(shù)次后，將其制成勻漿，測量其容積，以其二倍量乙醚脫脂，離心1 500 r·min-1，15 min。棄去上層脂質(zhì)，下層即為豬蛔蟲抗原；②用豬蛔蟲抗原對犬做皮膚過敏實驗：選用10～16 kg 的犬，先靜脈注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液5 mL，然后立即在犬腹壁皮內(nèi)注射0.5%豬蛔蟲抗原0.1 mL，30 min 后觀察反應(yīng)結(jié)果，如皮丘形成藍斑，直徑為1～2 cm 即皮膚過敏試驗陽性；③用過敏試驗陽性的犬做激發(fā)實驗［43］。

方法評價：用犬制作此模型具有特異性，而且此模型較上述動物哮喘模型便于觀察呼吸動力學變化，本模型適用于哮喘病理生理和藥物治療研究，但應(yīng)注意麻醉深度對哮喘激發(fā)的影響。

將犬以2.5%硫噴妥鈉10 mg·kg-1靜脈誘導麻醉后行氣管插管靜脈麻醉后，生理記錄儀描記錄呼吸曲線，超聲霧化吸入0.5%豬蛔蟲抗原蛋白2～5 min 后，當犬出現(xiàn)呼吸頻數(shù)或呼吸困難、哮鳴音，測定呼吸總阻力上升值為激發(fā)前基礎(chǔ)值的2 倍以上時，確定為過敏性哮喘［44］。

注意事項：多數(shù)犬（約占70%～80%）有犬蛔蟲感染，體內(nèi)產(chǎn)生高濃度抗體IGE，而這些抗體與豬蛔蟲抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。因而，模型制作時，首先要挑選有犬蛔蟲感染的犬，即皮膚過敏實驗陽性的犬才能保證模型復制成功。

2.4 屋塵螨誘發(fā)動物支氣管哮喘

方法概述：①屋塵螨的制備。純化培養(yǎng)的屋塵螨用乙醚脫脂，然后將30 mL 磷酸鹽緩沖溶液加入1 g屋塵螨中，在冰浴中搖勻后加入70 mL 磷酸鹽緩沖溶液，攪拌或旋轉(zhuǎn)2 天，將混合物4℃離心30 min，除去上清液并在蒸餾水中透析48 小時，然后將其凍干，儲存在-20℃?zhèn)溆?。②誘發(fā)動物哮喘。首先用氫氧化鋁生理鹽水腹腔注射使其活躍致敏，然后用屋塵螨氣霧劑吸入致敏。

方法評價：本模型適合用于哮喘發(fā)病機制以及藥物有效性的研究。屋塵螨攻擊后，炎性細胞和嗜酸粒細胞數(shù)量顯著增加，另外發(fā)現(xiàn)該模型中豚鼠吸入屋塵螨后立即引起支氣管收縮，6 h 達到最大值，第二波支氣管收縮在攻擊12 h 后開始，約24 h 達到最大值。

選取350～550 g 雄性豚鼠，在第0 和第7 天腹腔內(nèi)注射0.8 mL 5%的氫氧化鋁生理鹽水溶液，并在第21天進行屋塵螨氣霧劑吸入攻擊，將豚鼠置于10 L 的盒子中，屋塵螨濃度為1 mg·mL-1，8 L·min-1吹10 min［45］。

2.5 藥物性支氣管哮喘

2.5.1 豚鼠

方法概述：許多藥物以氣霧法給予豚鼠可引起支氣管痙攣、窒息，從而導致抽搐而跌倒。目前最常用的引喘藥物是組胺和乙酰膽堿。

方法評價：這種動物模型可用于觀察支氣管平滑肌松弛作用。測定引喘潛伏期，動物是否因呼吸困難、窒息而跌倒。一般觀察6 min，不跌倒者，引喘潛伏期以360 s 計算。

吳等［46］選用體質(zhì)量180～220 g 的健康豚鼠幼鼠，分別置于玻璃鐘罩內(nèi)，超聲波霧化器以400 mmHg 的壓力噴人 2% 氯化乙酞膽堿和0.1% 磷酸組胺等量混合液5 s，噴霧停止后觀察豚鼠的引喘潛伏期。亦可選用300～500 g 豚鼠暴露于0.1%w/v 的組胺二鹽酸鹽氣溶膠或暴露于0.5%w/v 的乙酰膽堿溴化物氣溶膠［47-48］。

注意事項：①引喘潛伏期是從噴霧開始到哮喘發(fā)作、前肢縮抬、點頭或腹式呼吸、呼吸極度困難，直至抽搐跌倒的時間，一般不超過120 s，超過者則認為不敏感，不予選用［49］；②每只豚鼠每天只能測定一次潛伏期，同一天內(nèi)多次測定，會影響實驗結(jié)果；③抗組胺藥無直接松弛支氣管平滑肌作用，但用于這種動物模型，也能得到平喘效果。因此，在分析實驗結(jié)果時應(yīng)排除這種假陽性現(xiàn)象［46］。

2.5.2 大鼠

選用雌性SD 大鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量（180±15） g，放于自制的密閉玻璃箱內(nèi)，超聲霧化0.5%磷酸組胺鹽生理鹽水溶液刺激大鼠，觀察大鼠吸入組胺后的呼吸變化情況，選擇吸入組胺后20 s 內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、前肢縮抬、點頭或腹式呼吸等哮喘癥狀的大鼠作為實驗用鼠［49］。

2.6 條件免疫反應(yīng)哮喘［50-52］

方法概述：豚鼠體質(zhì)量190～230 g，平均22.5 月齡。采用經(jīng)典的聲光刺激為條件刺激，以5%卵白蛋白抗原激發(fā)豚鼠引發(fā)支氣管哮喘為非條件刺激結(jié)合強化訓練6 周。于第6 周開始僅予以條件刺激，用0.9%生理鹽水代替5%卵白蛋白做為非條件刺激，誘發(fā)豚鼠的支氣管哮喘發(fā)作。

方法評價：激發(fā)陽性標準：豚鼠呼吸急促、咳嗽、躁動、口唇、雙眼、耳紫紺，大小便失禁，雙肺聞及哮鳴音，呼吸曲線顯示頻率增加，幅度降低，出現(xiàn)嘆氣樣深呼吸，呼吸波大于3 次/分鐘，肺總阻力基礎(chǔ)值升高＞100%；病理觀察可見，雙肺呈白色，體積增大，邊緣變鈍［52］。支氣管黏膜水腫，并見有中性粒細胞出現(xiàn)，管壁及支氣管周圍組織和肺泡由嗜酸細胞、中性白細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落管腔內(nèi)有嗜酸細胞，黏液栓及支氣管變窄等。

①致敏方法：10%卵白蛋白與生理鹽水混合20 mL，注入豚鼠，致敏1 周重復一次；②抗原激發(fā)：于豚鼠第2 次致敏2 周后進行抗原激發(fā)。將豚鼠描記完基礎(chǔ)呼吸曲線后，置入條件免疫反應(yīng)哮喘噴霧箱內(nèi)，首先予以閃爍紅燈信號（波長為7 000 埃）和間歇警笛刺激（頻率為4 000 Hz，間歇頻率為90 次·min-1，聲音強度40 分貝）5 min，接著不停止信號刺激，予以抗原（5%卵白蛋白）激發(fā)5 min，氣量基本達到飽和，于激發(fā)后5 min 分別描記呼吸曲線，肺部聽診。然后仍放在呼吸描記箱內(nèi)，不予以燈光和警笛刺激，直接予以5%卵白蛋白抗原激發(fā)5 min，再描記呼吸曲線，肺部聽診［50］。

注意事項：①豚鼠進飼養(yǎng)室后最初5 天為環(huán)境適應(yīng)期，并每日被觸摸3 min 以適應(yīng)實驗人員的操作，正式實驗時予以隔離；②在實驗的前1 d，盡量避免受試動物接觸條件刺激［51］；③條件刺激：給予燈光和警笛刺激，同時予以抗原激發(fā)；④正常豚鼠的呼吸頻率為66～120 次/分鐘，平均92.5 次/分鐘。

2.7 滅活的呼吸道合胞病毒致哮喘（respiratory syncytial virus，RSV）

2.7.1 RSV 激發(fā)小鼠哮喘動物模型

方法概述：用紫外線滅活的呼吸道合胞病毒致敏和刺激小鼠，制備小鼠哮喘動物模型，與卵白蛋白致敏進行比較。

方法評價：有報道稱RSV 可以在整個生命中引起反復感染，通常伴有相關(guān)的中度感冒癥狀［53］。紫外線滅活的RSV 致敏組與卵白蛋白致敏組相比，激發(fā)小鼠的哮喘癥狀明顯，氣道中漿細胞和嗜酸性粒細胞浸潤明顯增多，與臨床上支氣管哮喘的發(fā)作和病理改變十分相似，而且激發(fā)后48 h 的氣道炎癥表現(xiàn)最為明顯。因此，用紫外線滅活的呼吸道合胞病毒致敏和刺激小鼠制備小鼠哮喘動物模型是一種較理想的小鼠哮喘動物模型，且激發(fā)后48 h 的小鼠模型較為理想［54］。但也有報道［55］，單純RSV 感染僅為嚴重的肺泡炎癥改變，如果卵白蛋白致敏條件下RSV 感染可加重氣道炎癥。

取4～6 周 齡 雌 性BALB/C 小 鼠（14±2） g，紫 外線滅活的RSV 致敏組小鼠第1 天腹腔注射0.1 mL 生理 鹽水（含6.25×105PFU 紫外 線 滅活的RSV 和 氫氧化鋁20 μg），第8 天重復注射，第21 天腹腔麻醉后取0.1 mL 生理鹽水（含6.25×105PFU 紫外線滅活的RSV），對小鼠鼻腔內(nèi)緩慢滴入以激發(fā)小鼠哮喘。卵白蛋白致敏組小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 mL 生理鹽水（含卵白蛋白10 μg，氫氧化鋁20 μg）兩次，間隔1 周，末次致敏后14 天開始以5%的卵白蛋白霧化吸入，每天20 min，連續(xù)6 天［54］。

2.7.2 RSV 激發(fā)豚鼠哮喘動物模型

方法概述：用呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus pneumonia，RSV）刺激卵白蛋白致敏的豚鼠，制備豚鼠哮喘動物模型，與單獨卵白蛋白致敏進行比較。

方法評價：這些卵白蛋白和RSV 組與單獨的RSV和單獨的卵白蛋白組合相比存在組織學變化，包括氣道上皮壞死，單核和粒細胞浸潤，氣道壁水腫，支氣管相關(guān)淋巴組織增生和杯狀細胞化生。先前存在的過敏狀態(tài)增加了豚鼠非特異性氣道對乙酰膽堿激發(fā)和氣道炎癥的反應(yīng)性，加劇了豚鼠急性RSV 細支氣管炎期間氣道反應(yīng)性的增加。

取8 周齡豚鼠，體質(zhì)量（484±37） g，通過氣霧劑給予1%卵白蛋白和4%熱滅活的百日咳博德特氏菌疫苗使豚鼠致敏，致敏后7 天，動物暴露于0.5%卵白蛋白氣溶膠中，每周兩次，連續(xù)4～5 周。每次暴露前1 小時，腹腔注射苯海拉明（8 g）避免過敏反應(yīng)。用氟烷麻醉豚鼠，鼻腔滴注0.1 mL 人RSV 培養(yǎng)基接種（含4 000 PFU 的RSV）［56］。

2.7.3 RSV 激發(fā)大鼠哮喘動物模型

方法概述：用含RSV 的培養(yǎng)基刺激大鼠，制備大鼠哮喘動物模型，與不含RSV 的培養(yǎng)基滴注鼻孔進行比較。

方法評價：與對照組相比，RSV 組出現(xiàn)了幾種異常行為，毛蓬松，呼吸加快，不愿進食等。另外肺組織呈現(xiàn)彌漫性充血，水腫和質(zhì)地松散，而且出現(xiàn)了高度嚴重的肺間質(zhì)炎癥。

①RSV 的培養(yǎng)。約10 μL 的RSV 加入2 mL RPMI-1640 培養(yǎng)基補充2%胎牛血清然后引入HeLa 細胞，2～3 天后觀察到細胞病變。當細胞病變效果達到90%～100%，將25 cm2的塑料瓶劇烈搖動，并冷凍，解凍重復三次。通過離心（1 000 r·min-1，5 分鐘）獲得RSV 懸浮液，然后調(diào)整50%組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）至5×104TCID50/0.1 mL；②致敏。選取雌性SD 大鼠，體質(zhì)量（60～80） g，第一天和第十四天給大鼠腹腔內(nèi)注射1 mL 敏化液（含1% OVA 和100 mg 氫氧化鋁），第15 天大鼠吸入1%OVA 氣霧劑（2 升/分鐘）連續(xù)3 周，在第28，31，34 天，大鼠鼻腔內(nèi)緩慢滴加100 μL 生理鹽水（含1×106PFU 的RSV）刺激大鼠哮喘［57］。

總之，動物模型是人類哮喘發(fā)病機制，作用靶點，藥物有效性研究的重要途徑。目前，已發(fā)現(xiàn)的可作為哮喘模型的動物種類很多，哮喘動物模型建立的方法也多種多樣。然而哮喘模型的建立受到遺傳背景、致敏原、劑量與時間等多因素的制約，且不能自發(fā)的發(fā)生哮喘。因此，要綜合考慮哮喘模型建立的方法、種類、用途及實際條件等選擇最優(yōu)的方案。另外目前很多構(gòu)建動物模型的方法仍存在很多問題，并不能完全模擬人類，需進一步研究從而更好地了解哮喘及其潛在細胞、分子機制的關(guān)系，以開發(fā)新的治療方法［58］。隨著人類支氣管哮喘病因、發(fā)病機制研究的不斷完善，相信會探索出一種更適合支氣管哮喘的實驗動物模型。